Development of multiplex PCR assays for detecting Chlamydia-related bacteria and their natural host, free-living amoebae

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201905021802
Title: Development of multiplex PCR assays for detecting Chlamydia-related bacteria and their natural host, free-living amoebae
Author: Virtanen, Kira
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Thesis level: master's thesis
Abstract: In addition to Chlamydiaceae, eight novel families have been discovered to belong to the phylum Chlamydiae. The eight families are Parachlamydiaceae, Waddliaceae, Criblamydiaceae, Parilichlamydiaceae, Rhabdochlamydiaceae, Simkaniaceae, Clavichlamydiaceae and Piscichlamydiaceae.These families are phylogenetic relatives to Chlamydiaceae, share the intracellular developmental cycle and are widely distributed in nature and are therefore referred to as environmental Chlamydiae or Chlamydia related bacteria (CRB). CRB have a broad range of potential hosts. All families except Criblamydiaceae cause disease in animals and infect for example fish, arthropods and cattle. Families Parachlamydiaceae, Waddliaceae, Rhabdochlamydiaceae and Simkaniaceae are also shown to cause respiratory disease and adverse pregnancy outcomes in human. Free-living amoebae (FLA) are natural hosts of some CRB. CRB are able to survive and replicate inside of FLA that offers protection and nutrients for CRB. It has been suggested that CRB are transported to new environments inside of FLA. CRB DNA has previously been found on human skin (Hokynar et al. 2016, Hokynar et al. 2018, Tolkki et al. 2018) and in our water distribution system. CRB distributed to our tap- and shower water systems inside of FLA (Thomas and Ashbolt 2011) could be a potential rout of transmission of CRB DNA to human skin. As the diversity and size of the CRB group is large and CRB are very laborious to grow in vitro, it is challenging to detect CRB and to study their pathogenicity. Detection of CRB in clinical and environmental samples is mainly based on PCR methods. A non species-specific PCR method targeting Chlamydiales 16S rRNA (PanChl16S), that in theory amplifies all known CRB, has successfully been used in detection, but post PCR sequencing of the amplicon is required to identify the species. Also, more specific quantitative PCRs have been designed to detect specific families or species of Chlamydiae. However, the volume of clinical specimens available is often limited and allows only few separate analyzes. Due to the challenges identified with detection of CRB, efficient multiplex PCR assays would save time and resources and would be useful tools when detecting CRB DNA. The objective of the work was to explore the possibility of applying multiplexed analyzes to a limited specimen volume effectively. One aim of this thesis was to set up two multiplex PCR assays for detection of seven different CRB and a multiplex PCR for detection of three different FLA. Another aim of the work was to analyze the possibility of CRB to be transported to human skin from our water distribution system inside of FLA. In this thesis we set up two multiplex PCR assays for detection of CRB reference strains P. acanthamoebae, C. sequanensis, S. negevensis, Protochlamydia spp., Rhabdochlamydia spp., W. chondrophila and E. lausannensis. We also set up two PCR assays for detection of three different FLA reference strains: Acanthamoeba spp., Vahlkampfiidae spp., and V. vermiformis. We succeeded in developing two real-time multiplex PCR assays for detection of CRB DNA and two real-time PCR assay for detection of FLA DNA. Variability between replicates for each PCR target was low and the detection limit (100%) for each target ranged from 50-500 control plasmid copies per PCR reaction. The R2-value for each target was ≥0.98 and the reaction efficiency for each target ranged from 82-111%. Samples collected from showerheads (n=18) and water filters (n=2) as well as skin swabs (n=27) were studied with these newly established assays and PanChl16S PCR. The results obtained with the multiplex assays developed in this study were similar to the results obtained with the PanChl16S. CRB DNA was detected in 67% of the showerhead samples, in 100% of the water filter samples and in 31% of the skin swabs. Amoebae DNA was detected in 80% of the showerhead samples. Our results confirm earlier observation that Chlamydiae DNA is frequently observed in human skin swabs and suggest that CRB could be transported to human skin from our water distribution system inside of FLA.Förutom Chlamydiaceae har det upptäckts åtta nya familjer som tillhör phylumet Chlamydiae. Dessa åtta familjer är Parachlamydiaceae, Waddliaceae, Criblamydiaceae, Parilichlamydiaceae, Rhabdochlamydiaceae, Simkaniaceae, Clavichlamydiaceae och Piscichlamydiaceae och är fylogenetiska släktingar till Chlamydiaceae. Liksom Chlamydiaceae, har även dessa familjer en intracellulär utvecklingscykel, är brett utspridda i naturen och kallas därför ofta för miljö-Chlamydia eller Chlamydia-relaterade bakterier (CRB). CRB har ett brett spektrum av potentiella värdar. Alla familjer förutom Criblamydiaceae är djurpatogener och infekterar bland annat fiskar, leddjur och nötkreatur. Familjerna Parachlamydiaceae, Waddliaceae, Rhabdochlamydiaceae och Simkaniaceae har även bevisats orsaka luftvägsinfektion samt missfall hos människor. Fritt-levande amöbor (FLA) är naturliga värdar för vissa CRB. CRB kan överleva och replikeras inne i FLA som erbjuder skydd och näringsämnen för CRB. Det har föreslagits att CRB transporteras till nya omgivningar inne i FLA. CRB DNA har detekterats i svabb prover av mänsklig hud (Hokynar et al. 2016, Hokynar et al. 2018, Tolkki et al. 2018) och i vårt vattendistributionssystem. CRB distributerade i vårt kran- och duschvatten inne i FLA (Thomas and Ashbolt 2011) kunde vara en potentiell överföringsväg av CRB DNA till människohud. Det är svårt att detektera CRB samt att studera deras roll som patogena bakterier, eftersom gruppen är mångfaldig och stor och CRB är svåra att odla in vitro. PCR metoder används främst för att detektera CRB DNA i miljö- och kliniska prover. Icke artspecifika PCR metoder som detekterar Chlamydiales 16S rRNA (PanChl16S), och i teorin detekterar alla hittills kända CRB arter, har framgångsrikt använts. För att identifiera specifika arter när man använder PanChl16S krävs det dock sevensering av det multiplicerade DNA fragmentet. Även artspecifika, kvantitativa PCR metoder har utvecklats och använts för detektion av DNA från specifika CRB familjer eller arter. Volymen på prover är dock ofta begränsad, vilket resulterar i att endast några få separata analyser är möjliga. På grund av de identifierade utmaningarna i att detektera CRB skulle effektiva multiplex PCR metoder spara tid och resurser samt vara effektiva metoder för att detektera CRB DNA. Syftet med detta arbete var att undersöka möjligheten att effektivt tillämpa multiplexade analyser till en begränsad provvolym. Ett av målen i denna avhandling var att etablera två multiplex PCR reaktioner för att detektera olika CRB samt en multiplex PCR reaktion för att detektera tre olika FLA. Ett annat mål var att analysera möjligheten att CRB kunde transporteras till människohud från vårt vattendistributionssystem inne i FLA. I denna avhandling utvecklades två multiplex PCR reaktioner för detektion av CRB referensstammar P. acanthamoebae, C. Sequanensis, S. negevensis, Protochlamydia spp., Rhabdochlamydia spp., W. chondrophila och E. lausannensis. Det utvecklades även två PCR reaktioner för detektering av tre FLA referensstammar: Acanthamoeba spp., Vahlkampfiidae spp., and V. vermiformis. Vi lyckades skapa två multiplex PCR reaktioner för detektion av CRB DNA samt två PCR reaktioner för detektion av FLA DNA. För varje målsekvens var variationen låg mellan replikaten och detekteringsgränsen varierade mellan 50–500 kontroll plasmidkopior per PCR reaktion. R2-värdet för varje målsekvens var ≥0.98 och effektiviteten varierade mellan 82–111%. Prover samlade från duschhuvuden (n=18) och vattenfilter (n=2) samt hudsvabbar från människor (n=27) analyserades med de nyetablerade PCR reaktionerna samt PanChl16S PCR. Resultaten erhållna med multiplex PCR reaktionerna var likformiga med resultaten erhållna med PanChl16S. CRB DNA detekterades i 67% av duschhuvuden, i 100% av vattenfiltren och i 31% av hudsvabbarna. Amöba DNA detekterades i 80 % av duschhuvuden. Våra resultat stöder även tidigare observationer om att Chlamydiae DNA ofta påträffas i hudsvabbar samt att CRB kunde transporteras till människohud från vårt vattendistributionssystem inne i FLA.
URI: URN:NBN:fi:hulib-201905021802
http://hdl.handle.net/10138/301485
Date: 2019
Subject: Chlamydia-related bacteria
free-living amoebae
multiplex PCR
Discipline: yleinen mikrobiologia
General Microbiology
allmän mikrobiologi


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record