CRISPRa mediated pluripotency reprogramming of biobanked lymphoblastoid cell lines

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2019100130659
Title: CRISPRa mediated pluripotency reprogramming of biobanked lymphoblastoid cell lines
Author: Laiho, Laura
Contributor: Helsingin yliopisto, Bio- ja Ympäristötieteellinen tiedekunta, Biotieteiden laitos
Date: 2018-08-28
URI: http://hdl.handle.net/10138/305560
http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2019100130659
Thesis level:
Abstract: Lymphoblastoid cell line (LCL) collections offer a vast source of biological data of various diseases stored in biobanks. Even though LCLs have been used as a conducive surrogate in vitro cell model to study various diseases, it has been shown that they cannot recapitulate all the regulatory properties of a disorder specific primary tissue, constraining the utility of the collections. The rise of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has offered a novel strategy for repurposing the abundant LCL collections for regenerative medicine, drug discovery and disease modeling. However, the cell-type-specific reprogramming events in LCLs are not understood, hindering the development of a more efficient and reliable reprogramming method for these cell lines. To systematically study the endogenous events taking place during the reprogramming process, the CRISPR/Cas mediated gene activation (CRISPRa) platform has been harnessed in fibroblasts. This thesis work aimed to establish the novel CRISPRa mediated reprogramming method for the first time in biobanked LCLs, obtained from the Psychiatric Family Collections of THL Biobank. The method relies on the activation of the endogenous pluripotency factors with CRISPR activators, which results in the induction of the reprogramming process. The screening of different factor combinations revealed that the successful reprogramming of LCLs seems to require the targeting of the EEA motif, a genomic element which is enriched in promoter regions of genes related to embryo genome activation. The reprogramming efficiencies were however varying, and a gRNA function validation assay showed that the gRNAs used in this project were suboptimal for efficient gene activation in LCLs. The reprogramming method was nevertheless demonstrated to successfully convert five biobanked LCLs into bona fide iPSC lines. The iPSC lines generated in this thesis serve as a proof of concept that the novel CRISPRa reprogramming method works in biobanked LCLs and could be developed to systematically study the cell-type-specific reprogramming events in these cells. Also, the generated iPSC line collection constitutes the first iPSC collection derived from biobanked cells with the CRISPRa reprogramming method and is available as a future research resource, thus paving the way for the wider use of the LCL collections.Biopankkeihin tallennetut lymfoblastoidisolulinjakokoelmat tarjoavat laajan biologisen datalähteen monien sairauksien tutkimiseen. Näitä verisoluista peräisin olevia solulinjoja on käytetty menestyksekkäästi tautisolumallina useissa in vitro -tutkimuksessa. Ne eivät kuitenkaan pysty täysin toistamaan sairausspesifisten primäärisolutyyppien kaikkia säätelyominaisuuksia, mikä on rajoittanut kokoelmien käytön vain tietynlaiseen tutkimukseen. Indusoituihin monikykyisiin kantasoluihin (iPS-soluihin) perustuva teknologia on kuitenkin tarjonnut uudenlaisen strategian kokoelmien monipuolisempaan hyödyntämiseen uusiutuvan lääketieteen, lääkekehityksen ja sairausmallinnuksen saralla. Lymfoblastoidisolujen solutyyppispesifisiä uudelleenohjelmointitapahtumia ei kuitenkaan tunneta tarkasti, mikä hidastaa uusien tehokkaampien ja luotettavimpien uudelleenohjelmointimenetelmien kehittämistä. CRISPR/Cas välitteinen geeniaktivaatio (CRISPRa) saattaa tarjota tähän uusia työkaluja, sillä se on jo valjastettu endogeenisten uudelleenohjelmointitapahtumien systemaattiseen tutkimiseen fibroblasteissa. Tämän Pro gradu -tutkielman tavoitteena oli osoittaa ensimmäistä kertaa CRISPRa välitteisen uudelleenohjelmointimenetelmän toimivuus THL Biopankin psykiatrisesta perhekokoelmasta saaduissa lymfoblastoidisolulinjoissa. Menetelmä perustuu solujen endogeenisten pluripotenssitekijöiden aktivointiin CRISPR-aktivaattoreilla, joka johtaa uudelleenohjemointiprosessiin soluissa. Eri pluripotenssitekijäkombinaatioiden joukosta löydettiin tehokkain yhdistelmä, ja tulosten perusteella näiden solulinjojen uudelleenohjelmointi näytti vaativan EEA-motiivin aktivoinnin. EEA-motiivi on genominen elementti, joka on rikastunut alkion genomiaktivaatioon liittyvien geenien promoottorialueille. Uudelleenohjelmointitehokkuus oli kuitenkin vaihteleva, ja osittaiseksi syyksi nähtiin projektissa käytettyjen opas-RNA:iden huono aktivaatioteho tässä solutyypissä. Menetelmä osoitettiin kuitenkin toimivaksi näissä soluissa, sillä viisi eri lymfoblastoidisolulinjaa saatiin onnistuneesti uudelleenohjelmoitua iPS-solulinjoiksi. Tässä projektissa tuotetut iPS-solulinjat ovat osoitus siitä, että CRISPRa välitteinen uudelleenohjelmointimenetelmä toimii biopankkeihin tallennetuissa lymfoblastoidisolulinjoissa, ja tulevaisuudessa menetelmää voidaan kehittää solutyyppispesifien uudelleenohjelmointitapahtumien systemaattiseen tutkimiseen. iPS-solulinjakokoelma on lisäksi ensimmäinen CRISPRa menetelmällä tuotettu kokoelma, joka on saatavilla tutkimukseen THL biopankista, näin mahdollistaen lymfoblastoidisolulinjakokoelmien laajemman tutkimuskäytön.
Discipline: Molekyylibiotieteet


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Laura Laiho Pro gradu for e-thesis.pdf 2.564Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record