Microfluidics and Nanotechnology in Pharmaceutical Analysis and Drug Metabolism Research

Show full item record

Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-5541-2
Title: Microfluidics and Nanotechnology in Pharmaceutical Analysis and Drug Metabolism Research
Author: Ollikainen, Elisa
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Division of Pharmaceutical Chemistry and Technology
Doctoral Programme in Drug Research
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2019-10-18
Belongs to series: Dissertationes Scholae Doctoralis Ad Sanitatem Investigandam Universitatis Helsinkiensis - URN:ISSN:2342-317X
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-5541-2
http://hdl.handle.net/10138/305647
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Drug metabolism is an important area of pharmaceutical research as it has significant effects on safety and efficacy of the therapy. Cytochrome P450 (CYP) enzymes metabolize the majority of clinically used drugs and have thus a critical role in their elimination process. Alterations in CYP activities can lead to unexpected adverse effects and toxicity (low activity), or on the other hand to complete lack of efficacy (high activity). Wide inter-individual variation in CYP activities is observed due to polymorphism as well as other individual and external factors. The emerging approach, called precision medicine, aims to increase the efficacy and safety of the treatment by considering the individual characteristic of the patient. The medication is then prescribed based on this information together with the diagnosis. Individual variation in CYP activities is one of the factors that should be considered when designing the treatment. Another aspect of precision medicine is targeted drug delivery with help of nanocarriers, which enables controlled release and accumulation of the drug at the targeted site. This approach improves the bioavailability of the drug and thus also the efficacy of the treatment, whereas side effects and toxicity can be decreased. Chemical analysis of a variety of different samples is involved in all areas of pharmaceutical research. Miniaturization of the analytical techniques results in fast and simple analysis of small sample volumes with reduced costs. Simple and portable miniaturized analytical decives have also enabled point-of-care analysis in e.g., doctor’s office. These techniques could provide valuable tools also for precision medicine and screening of the individual characteristics. However, the robustness, precision, and sensitivity of the microfluidic analytical devices should be further addressed before these techniques can compete with conventional methods in pharmaceutical research. The aim of this thesis was to evaluate the feasibility of microfluidic analytical techniques for pharmaceutical research. A particular emphasis was put on drug metabolism and its impacts on precision medicine. In the first subproject of this thesis, the effect of nanoformulations on CYP metabolism were determined in vitro. Three types of porous silicon (PSi) nanoparticles and three polymers commonly used in the same nanoformulations were investigated. Statistically significant alterations were observed in activities of the studied isoenzymes in the presence of the PSi nanoparticles, whereas polymers had less effect on the enzyme kinetic parameters. The highly polymorphic CYP2D6 was found to be most prone to inhibition by both the nanoparticles and the polymers. The results demonstrate the risk of interactions caused by other components of the (nano)formulations than the active ingredients. The effects of nanocarriers on CYP metabolism should be further investigated both in vitro and in vivo, to be able to evaluate the overall effects on CYP metabolism. In the second subproject, a paper microfluidic assay was developed for rapid screening of the inter-individual differences in CYP enzyme activities. The multiplexed microfluidic lateral flow assay was based on a paper-like functionalized calcium carbonate coating and inkjet printed hydrophobic fluid barriers. The assay was applied to study of individual differences in CYP2A6 and CYP1A2 activities in (human) liver microsomes (HLM) of individual donors. The determined CYP activities were compared to average activities in a 20-donor subpopulation. The results showed both increased and decreased enzyme activities in the HLM of individual donors compared to the pooled HLM. However, based on the comparison to in-solution assays, further validation of the microfluidic lateral flow assay is needed to reach the robustness and sensitivity required for routine use. In the third subproject, a commercial microchip electrophoresis (MCE) device with integrated electrochemical (EC) detection was applied to CYP metabolism studies and to analysis of morphine in mouse plasma and brain samples. The method developed for analysis of CYP metabolites showed good selectivity and precision. However, the sensitivity of the MCE-EC method was found insufficient for CYP metabolism studies. Instead, MCE-EC was shown to be feasible for quantitation of intraperitoneally administered morphine in mouse plasma and brain. Quantitation of morphine from biological samples was achieved with good precision and accuracy after off-chip liquid-liquid extraction (LLE) and on-chip electrokinetic stacking demonstrating the capability of MCE in targeted quantitative analysis. In the fourth subproject, MCE was combined with electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS). The method was applied to separation of phosphorylated peptides, particularly the positional phosphorylation isomers, which is a challening task for conventional analytical techniques. The feasibility of the method was demosntrated with the help of monophosphorylated and triply phosphorylated insulin receptor peptides, which could be separated from the nonphosphorylated peptide in less than 40 s. The separation of the monophosphorylated peptide isomers from each other was achieved after derivatization. In conclusion, with help of selected applications, this thesis demonstrates the advances that microfluidics could provide for conventional pharmaceutical analysis and drug metabolism studies. MCE was shown to be suitable for quantitative analysis with good precision and selectivity. Sensitivity is a common challenge in the field of microfluidics, but with carefully selected method for each application, these techniques can reach the benefits of miniaturized analytical devices. Further improvements in integration of the sample pretreatment and enrichment on the same microchip would also enhance the sensitivity as well as decrease the variation associated with manual sample handling.Miniatyrisoituja analyysilaitteita on tutkittu jo kymmenien vuosien ajan, mutta ne eivät ole saaneet sijaa perinteisten menetelmien rinnalla. Miniatyrisoidut menetelmät ovat hyvin nopeita ja edullisia, ja niillä voidaan analysoida hyvin pieniä määriä näytettä. Näiden menetelmien suurimpia haasteita ovat kuitenkin analyysien toistettavuus sekä hyvin pienten pitoisuuksien havaitseminen. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin miniatyrisoitujen analyysilaitteiden soveltuvuutta farmaseuttisen tutkimuksen tarpeisiin ja erityisesti lääkeaineiden metabolian tutkimiseen. Lääkeaineet metaboloituvat eli muuntuvat elimistössä sytokromi P450 (CYP) -entsyymien vaikutuksesta helpommin eritettävään muotoon. CYP-entsyymien aktiivisuudessa on kuitenkin merkittäviä eroja yksilöiden välillä, mikä voi lisätä vakavien haittavaikutusten riskiä tai toisaalta heikentää lääkeaineen tehoa. Yksilöllisten erojen huomioiminen lääkityksen valinnassa (täsmälääketiede, precision medicine) parantaa lääkehoidon tehoa ja turvallisuutta ja pienentää haittavaikutusten riskiä. Toinen täsmälääketieteen osa alue on lääkeaineiden kohdennettu annostelu haluttuun kudokseen nanopartikkelien avulla. Piistä valmistettuja nanopartikkeleita on kehitetty paljon lääkeaineiden annostelua varten, mutta niiden vaikutuksia CYP-entsyymeihin ei ole tutkittu aiemmin. Tässä työssä piipartikkelien todettiin vaikuttavan CYP-entsyymien aktiivisuuteen. Lopullisia johtopäätöksiä varten nanopartikkelien vaikutusta tulisi kuitenkin vielä tutkia elävillä soluilla ja mahdollisesti koe-eläimillä. Tulokset kuitenkin osoittavat, että nanopartikkelien turvallisuutta tutkittaessa myös mahdolliset vaikutukset CYP-entsyymeihin tulisi ottaa huomioon. CYP-entsyymien aktiivisuuden ja yksilöiden välisten erojen tutkimiseksi tässä työssä kehitettiin yksinkertainen paperinkaltaiselle materiaalille tulostamalla valmistettu laite. Perinteiset menetelmät yksilön CYP-entsyymien aktiivisuuden tutkimiseen ovat hitaita tai ne perustuvat geenitutkimukseen, mikä ei ota huomioon muita yksilön ominaisuuksia ja ympäristötekijöitä, jotka vaikuttavat myös merkittävästi entsyymien aktiivisuuteen. Tässä työssä kehitetyllä menetelmällä voidaan havaita myös muut kuin perimään perustuvat erot. Menetelmän osoitettiin toimivan erityisesti CYP1A2-entsyymin aktiivisuuden määrittämisessä, mutta muun muassa analyysin toistettavuus vaatii vielä kehitystyötä. Miniatyrisoituna erotusmenetelmänä käytettiin mikrosirulla tapahtuvaa elektroforeesia. Työssä käytettiin sekä kaupallisesti saatavilla olevia mikrosiruja että itse valmistettuja siruja. Kaupallisen laitteiston soveltuvuutta farmaseuttisen tutkimuksen tarpeisiin tutkittiin analysoimalla lääkeaineiden metaboliassa muodostuvia tuotteita sekä analysoimalla hiirten plasma- ja aivonäytteitä morfiinin annostelun jälkeen. Metaboliatuotteita muodostui lääkeaineista niin pieniä pitoisuuksia, että kaupallinen laitteisto ei kyennyt havaitsemaan niitä. Sen sijaan työssä osoitettiin, että kyseinen laitteisto mahdollistaa morfiinin pitoisuuden määrittämisen biologisista näytteistä luotettavasti ja toistettavasti. Näytteiden puhdistaminen ennen analyysia oli kuitenkin välttämätöntä. Mikrosiruelektroforeesi yhdistettiin myös massaspektrometriaan ja tätä menetelmää käytettiin fosfopeptidien analysoimiseen. Fosfopeptidit muodostuvat, kun pilkotaan proteiineja, jotka ovat fosforyloituneet. Proteiinien fosforyloitumista tapahtuu elimistössä muun muassa solujen välisessä viestinnässä. Moniin sairauksiin voi kuitenkin liittyä poikkeavan runsas tai vähäinen proteiinien fosforyloituminen, minkä takia sen tutkiminen on tärkeää. Perinteisille analyysimenetelmille se on kuitenkin haastavaa. Tässä yössä käytettiin malliaineena yhtä peptidiä sekä sen fosforyloituneita muotoja. Nämä eri muodot voitiin erottaa toisistaan alle 40 sekunnissa. Työssä kuvatut sovellukset osoittavat, että miniatyrisoidut analyysilaitteet soveltuvat jo monenlaisiin farmaseuttisiin analyyseihin. Haasteina ovat kuitenkin analyysien toistettavuus sekä hyvin pienten pitoisuuksien havaitseminen, jotka vaativat vielä kehitystä. Yhdistämällä samaan miniatyrisoituun systeemiin useita kemiallisen analyysin vaiheita (mm. näytteen puhdistaminen), laitteista saadaan nykyistä yksinkertaisempia käyttää, näytteiden analysointi olisi nopeampaa ja manuaalinen näytteiden käsittely vähentyisi. Samalla myös analyysien toistettavuus paranisi, mikä tekisi miniatyrisoiduista menetelmistä kilpailukykyisempiä perinteisiin menetelmiin verrattuna.
Subject: farmaseuttinen kemia
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
MICROFLU.pdf 2.028Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record