Revising the actin disassembly machinery : The role of GMF and twinfilin in turnover of dendritic actin arrays

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-5945-8
Title: Revising the actin disassembly machinery : The role of GMF and twinfilin in turnover of dendritic actin arrays
Author: Hakala, Markku
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Institute of Biotechnology
Doctoral Programme in Biomedicin
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020-03-20
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-5945-8
http://hdl.handle.net/10138/312660
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Polymerization of actin filaments against cellular membranes and contraction of actomyosin fibers generate pushing and pulling forces for cell migration, endocytosis, cell division, and maintenance of cell morphology, as well as for intracellular motility and morphogenesis of organelles. Thus, the actin cytoskeleton is a fundamental cellular component in development, immune responses, and in several other aspects of physiology. Moreover, the actin cytoskeleton is hijacked by viruses and pathogens during the infection process. Owing to their central role in above-mentioned cellular processes, actin and actin-binding proteins have been in the limelight of cancer research. Actin is a globular protein, which can polymerize into filaments and depolymerize back to monomers. Dozens of actin binding proteins regulate actin dynamics in cells. Whereas regulation of actin filament nucleation and filament elongation are relatively well understood, the disassembly is far more enigmatic topic. ADF/cofilin is the key actin disassembly factor. It belongs to a family of six actin depolymerizing homology (ADF-H) domain proteins, which all interact with actin or actin-related proteins. However, apart from ADF/cofilin, biochemical and cellular functions of the members of this protein family have remained elusive. In this work, I studied the cellular and biochemical roles of two ADF-H domain proteins, glia maturation factor (GMF) and twinfilin. I show that they both promote the disassembly of dendritic actin networks in cells, but by distinct mechanisms. GMF, which binds actin-related proteins (Arp) in the Arp2/3 complex, debranches dendritic actin networks in vitro. The data presented here show that GMF regulates the dynamics of lamellipodial, dendritic actin network in Drosophila cells and promotes collective border cell migration in vivo. Moreover, Drosophila GMF display a strong genetic interaction in cells and in vivo with another actin-regulatory protein, actin-interacting protein 1 (Aip1), indicating that they facilitate actin disassembly in a synergistic manner. Twinfilin interacts with actin monomers and actin filament barbed ends to inhibit actin polymerization. Moreover, it binds heterodimeric Capping Protein (CP) and membrane phosphatidylinositol phosphates (PIPs), which inhibit the actin-binding function of twinfilin. However, the molecular mechanism of this interaction has remained unknown. Thus, in the second part of the thesis I utilized a combination of mutagenesis and biochemistry, supplemented with molecular dynamics simulations, to reveal how PIPs inhibit twinfilin. Interestingly, twinfilin interacts with PIPs with a two-step mechanism. First, the CP-interaction motif in the carboxy-terminal (C-terminal) tail of twinfilin anchors the protein to plasma membrane. Subsequently, the actin-binding interface interacts with lipids, leading to inhibition of both the CP- and actin-binding activities of twinfilin. Cellular functions of twinfilin have remained elusive despite extensive studies in past decades. In the third part of the thesis, I generated mouse twinfilin knockout cell lines and showed that twinfilin regulates both actin and CP turnover in lamellipodia. Surprisingly, twinfilin promotes CP dynamics in cells and in vitro by uncapping filament barbed ends, thus providing an explanation why the localization of CP in cells is restricted to the very distal edge of lamellipodia. Moreover, biochemical experiments demonstrated that twinfilin itself does not accelerate filament disassembly after uncapping, but instead allows filaments to disassemble after removal of CP from actin filament barbed ends. These findings explain the diminished actin filament disassembly rates in lamellipodia of twinfilin-deficient cells. Together, the work presented here highlights the important roles of twinfilin and GMF in regulation of lamellipodial actin networks. Their distinct roles in actin disassembly show that actin turnover in dendritic arrays is maintained by several functionally different proteins which, in concert, facilitate the turnover of branched actin filament networks in cells.Aktiinisäikeiden solun kalvorakenteita vasten tuottama työntövoima sekä aktiini- ja myosiinikimppujen synnyttämä kimppujen supistumisvoima ylläpitävät muun muassa solujen liikkumista, kalvoliikennettä, jakautumista sekä solujen muodon ja rakenteen säilymistä. Näin ollen solujen aktiinitukiranka on välttämätön muun muassa yksilönkehityksessä ja immuunipuolustusjärjestelmässä. Useat virukset ja taudinaiheuttajat hyödyntävät aktiinikoneistoa päästäkseen soluun sisälle. Lisäksi aktiinitukirangan merkitys edellä mainituissa solubiologisissa tapahtumissa on tuonut aktiinin ja aktiinitukirankaa säätelevät proteiinit syöpätutkimuksen valokeilaan. Aktiini on pallomainen proteiini, joka kykenee pidentymään pitkiksi säikeiksi ja purkautumaan yksittäisiksi monomeereiksi. Aktiinisäikeiden pidentyminen ja sen säätelijät tunnetaan varsin hyvin. Sen sijaan purkautumiseen osallistuvat proteiinit ja niiden rooli on huonommin tiedossa. Useat tutkimukset viime vuosikymmeninä ovat osoittaneet, että ADF/kofiliinilla on keskeinen rooli aktiinisäikeiden purkautumisen säätelyssä. ADF/kofiliini kuuluu kuuden proteiinin muodostamaan proteiiniperheeseen, jotka kaikki sitoutuvat joko aktiiniin tai aktiinin kaltaisiin proteiineihin. Toisin kuin ADF/kofiliinin, muiden tämän perheen jäsenten biokemialliset ja solubiologiset toiminnot ovat huonosti ymmärrettyjä. Tässä tutkielmassa tutkin kahden tämän perheen proteiinin, GMF:n ja twinfiliinin, solubiologisia ja biokemiallisia toimintoja. Näytän, että ne molemmat osallistuvat haaroittuneiden aktiinisäieverkostojen purkautumiseen omilla hyvin erilaisilla tavoilla. GMF, joka sitoutuu aktiinin kaltaiseen proteiiniin (Arp) Arp2/3-kompleksissa, purkaa aktiinisäieverkostojen haaroja. Tämän tutkielman tulokset osoittavat, että GMF säätelee solun levyjalan aktiinisäikeiden kierrätystä ja on tärkeässä roolissa rajasolujen liikkumisessa banaanikärpäsen munakammion kehittymisen aikana. Lisäksi GMF:n ja toisen aktiinia säätelevän proteiinin, Aip1:n, geeniluennan samanaikainen hiljentäminen johti aktiinisäikeiden kertymiseen sekä viljellyissä soluissa että kärpäsen munakammioissa. Aiemmin on osoitettu, että twinfiliini sitoutuu sekä yksittäisiin aktiinimonomeereihin että aktiinisäikeiden nopeasti kasvaviin pluspäihin, estäen näin säikeiden pidentymistä. Tämän lisäksi twinfiliini sitoutuu aktiinisäikeiden pluspäihin sitoutuvaan CP-tulppaproteiiniin ja solukalvon PIP-lipideihin. PIP-lipidit estävät twinfiliinin sitoutumisen aktiiniin, mutta tämän säätelyn tarkka mekanismi on ollut tuntematon. Tässä työssä käytimme puhdistettuja proteiineja biokemiallisissa kokeissa sekä hyödynsimme tietokonemallinnusta selvittääksemme, miten twinfiliini sitoutuu PIP-lipideihin. Tuloksemme osoittavat, että twinfiliini sitoutuu lipideihin kaksiosaisella mekanismilla. Aluksi twinfiliinin häntä ankkuroi proteiinin solukalvoon, minkä jälkeen loppu proteiini aktiininsitoumisalueineen sitoutuu kalvoon. Näin ollen twinfiliinin kyky sitoa aktiinia ja CP:ia estyvät sen sitoutuessa solukalvon PIP-lipideihin. Twinfiliinin tarkka rooli aktiinisäikeiden säätelyssä soluissa on jäänyt toistaiseksi epäselväksi. Tässä tutkielmassa käytin hiiren soluja, joista olin estänyt twinfiliinin geenin ilmentymisen mutaatiolla, ja vertasin näitä soluja villityyppisiin soluihin. Näin osoitan, että twinfiliini säätelee sekä aktiinisäikeiden että CP:n dynamiikkaa solujen levyjaloissa. Twinfiliini poistaa CP:n aktiinisäikeiden plus-päistä ja siten edistää aktiinisäikeiden purkautumista soluissa. Tämä havainto selittää sen, miksi CP paikantuu solujen levyjalassa aivan solukalvon lähelle ja sen, miksi CP:n dynamiikka on huomattavasti nopeampaa soluissa kuin mitä sen biokemialliset ominaisuudet ennustavat. Tulokset selittävät myös sen, miksi aktiinisäikeiden lyhentyminen on hitaampaa soluissa, joista twinfiliinin ilmentyminen on estetty mutaatiolla. Tämä väitöskirjatyö osoittaa, että twinfiliinillä ja GMF:llä on tärkeä rooli solujen aktiiniverkostojen säätelyssä. Niiden hyvin erilaiset roolit aktiinisäikeiden purkautumisen säätelyssä osoittavat, että aktiinisäikeiden kierrätystä ylläpitää soluissa useat proteiinit yhteistyössä toistensa kanssa.
Subject: Molecular Cell Biology
Rights: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
revising.pdf 1.999Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record