Construction and characterization of a lentiviral construct containing a human endogenous AIRE promoter and AIRE cDNA

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202005052009
Title: Construction and characterization of a lentiviral construct containing a human endogenous AIRE promoter and AIRE cDNA
Author: Korpela, Markus
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202005052009
http://hdl.handle.net/10138/314678
Thesis level: master's thesis
Abstract: Geeniterapia-lääkekokeilut ovat yleistyneet merkittävästi viimeisen kymmenen vuoden aikana. Ensimmäiset geeniterapialääkkeet ovat tulleet hiljattain markkinoille. Geeniterapiakokeilut ovat pääsääntöisesti keskittyneet parantamaan monogeenisia tauteja siten, että taudinaiheuttajageeni korjataan potilaan omissa (ts. autologisissa) hematopoeettisissa kantasoluissa. Geenin korjaus suoritetaan usein lisäämällä potilaan perimään geeni lentiviruksella, joka kuuluu tiettyyn ryhmittymään retroviruksia. APECED-oireyhtymä (autoimmuuni polyendokrinopatia-kandidiaasi-ektodermidystrofia) on harvinainen ja monogeeninen autoimmuunisairaus, jonka yleisesti aiheuttaa resessiivinen mutaatio AIRE-geenin proteiinia koodaavalla alueella. Suomalaiseen tautiperimään kuuluva APECED on teoreettisesti parannettavissa palauttamalla APECED-potilaaseen henkilön omia AIRE-korjattuja hematopoeettisia soluja. APECED-oireyhtymään voi tarjota lisäymmärrystä tutkimalla lentivirus-plasmidia, jossa on endogeeninen AIRE-promoottori ja villityypin AIRE-proteiinia koodaava sekvenssi. Tämä mahdollistaa alustavan ymmärryksen toimivan geeniterapian kehittämiseksi. Tutkielman tavoitteena on tutkia maailman ensimmäistä lentivirus-plasmidia, joka sisältää 3’ päässä AIRE-promoottorin ja AIRE-proteiinisekvensiin. Kyseinen lentivirus kloonattiin ja sitten transfektoitiin laajasti käytettyyn ihmissolulinjaan, HEK293T. Solulinjasta pyrittiin havaitsemaan vastaavasti AIRE-mRNA:ta kvantitatiivisella PCR:llä ja Aire-proteiinia immunohistokemialla. AIRE-mRNA:ta ja proteiinia havaittiin merkittäviä määriä, mikä osoitti, että Aire:n geenisäätely plasmidissa eroaa sen havaitusta geenisäätelystä perimässä. Kyseessä on ensimmäinen plasmidi, jossa Aire:n ekspressiota säätelee sen oma endogeeninen promoottori, mikä mahdollistaa lisäymmärryksen kartuttamisen Aire:n säätelyn suhteen. Kyseisen lentivirus-plasmidin kloonaaminen on myös ensimmäinen tekninen toteutus, jossa lisätään AIRE-geeni jo olemassa olevaan lentivirus-systeemiin. Toisin sanoen tutkielma havainnollistaa ensimmäistä vaihetta kloonaus-prosessiketjussa, jolla voisi kehittää lentivirus-geeniterapian APECED-oireyhtymään.Gene therapy trials are becoming more common place with the first approved products having arrived onto markets within the last 5 years. Gene therapy trials have focused on diseases that are monogenic and curable through the reintroduction of autologous, gene-corrected hematopoietic stem cells with promising results. A popular method for gene-correction is through the integration of the wild-type gene into the patient’s genome with a class of retroviruses called lentivirus. APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy) is a rare, monogenic autoimmune disease that is caused by a recessive mutation within the AIRE gene coding region. APECED has a high prevalence within the Finnish population (1/25,000) and is theoretically curable through the transplantation of autologous gene-corrected hematopoietic stem cells. Therefore, creating and studying a lentivector carrying the endogenous AIRE promoter and coding region could provide insight and a preliminary foundation on how to begin to develop a viable gene therapy for APECED. The aim of this thesis was to generate and characterise the first lentivector containing the wildtype AIRE gene, specifically the proximal AIRE promoter and the AIRE open reading frame (ORF). The lentivector was constructed and then transfected into a human cell-line, HEK293T, from which qPCR and immunohistochemistry were used to detect for AIRE mRNA and protein, respectively. The presence of significant amounts of AIRE mRNA and protein indicated that the constructed plasmid was transcriptionally functional. It is the first plasmid to have Aire transcription regulated by its endogenous promoter and can provide future insight into gene regulation. As a lentiviral plasmid, it demonstrates the integrating of the AIRE gene into an existing lentiviral system and serves as a first step and a technical proof-of-concept in developing a gene therapeutic cure for APECED.
Subject: APECED
AIRE
Lentiviral gene therapy
Discipline: biokemia
Biochemistry
biokemi
Full text embargoed until: 2021-05-21


Files in this item

Files Size Format View

Embargo on files ends: 2021-05-21

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record