High‐content imaging and structure‐based predictions reveal functional differences between Niemann‐Pick C1 variants

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202005142101
Title: High‐content imaging and structure‐based predictions reveal functional differences between Niemann‐Pick C1 variants
Author: Vanharanta, Lauri; Peränen, Johan; Pfisterer, Simon; Enkavi, Giray; Vattulainen, Ilpo; Ikonen, Elina
Other contributor: Helsingin yliopisto, Lääketieteellinen tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Medicine
Helsingfors universitet, Medicinska fakulteten
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202005142101
http://hdl.handle.net/10138/314929
Thesis level: master's thesis
Abstract: LDL-peräisen kolesterolin solunsisäinen kuljetus on riippuvaista NPC1-nimisen proteiinin toiminnasta lyso- somien kalvorakenteissa. Kyseistä proteiinia koodaavassa geenissä esiintyvät NPC1-proteiinin normaalin toi- minnan estävät geenimutaatiot aiheuttavat hankalan kolesterolikertymäsairauden, joka ilmenee tyypillisesti hermosolujen rappeumana johtaen ennenaikaiseen kuolemaan lapsuusiässä. Ihmisen NPC1-proteiinia koodaava geeni on hyvin heterogeeninen. Osa tämän geenin sisältämistä geenimuunnoksista tiedetään haitattomiksi poly- morfioiksi, mutta osalla NPC1-taudin kantajista ja NPC1-potilaista on geenissään muutoksia, joiden toiminnal- linen merkitys on epäselvä. Eri tutkimuslaboratorioiden välillä jaettu NPC1 cDNA-konstrukti, joka tunnetaan nimellä NPC1 Wild-Type Variant (WT-V) ja, jota on käytetty villityyppi-NPC1 vertailunäytteenä monissa tut- kimuksissa, sisältää myös tiettyjen aminohappojen muutoksia verrattuna Genbankissa julkaistuun NPC1 viite- sekvenssiin. Havainnoidaksemme paremmin pieniä toiminnallisia eroavaisuuksia NPC1-varianttien välillä, ge- neroimme stabiilisti NPC1-poistogeenisessä taustassa AAVS1 safe-harbor-lokuksesta NPC1-variantteja eks- pressoivia ihmissoluja käyttäen CRISPR/Cas9-tekniikkaa. Tämän jälkeen hyödynsimme automaattista kuvanta- mista ja automaattista kuva-analyysia arvioidaksemme kvantitatiivisesti LDL:n indusoimaa muutosta lyso- somien kolesterolimäärässä ja rasvapisaroiden muodostumisessa. Tuloksemme osoittavat, että NPC1 WT-V konstruktin sisältämä L472P-aminohappomuutos heikentää NPC1-proteiinin toimintaa lysosomaalisen koleste- rolin kuljetuksessa. Atomistiset simulaatiot vihjaavat, että L472P-mutaatio kiertää NPC1-proteiinin kahden lu- minaalisen toiminnallisen osan asentoa toistensa suhteen ja hajottaa hiljattain karakterisoidun kolesterolinsiirto- tunnelin. Nämä tulokset paljastavat toiminnallisen vian NPC1 WT-V proteiinissa ja korostavat simulaatioiden, kvantitatiivisen kuvantamisen ja stabiilin proteiiniekspression merkitystä proteiinien toiminnallisten muutosten osoittamisessa.The human Niemann-Pick C1 (NPC1) gene encoding a 1278 amino acid protein is very heterogeneous. While some variants represent benign polymorphisms, NPC disease carriers and patients may possess rare variants, whose functional importance remains unknown. An NPC1 cDNA construct known as NPC1 wild-type variant (WT-V), distributed between laboratories and used as a WT control in several studies, also contains changes regarding specific amino acids compared to the NPC1 Genbank reference sequence. To improve the dissection of subtle functional differences, we generated human cells stably expressing NPC1 variants from the AAVS1 safe-harbor locus on an NPC1-null background engineered by CRISPR/Cas9 editing. We then employed high-content imaging with automated image analysis to quantitatively assess LDL-induced, time-dependent changes in lysosomal cholesterol content and lipid droplet formation. Our results indicate that the L472P change present in NPC1 WT-V compromises NPC1 functionality in lysosomal cholesterol export. All-atom molecular dynamics simulations suggest that the L472P change alters the relative position of the NPC1 middle and the C-terminal luminal domains, disrupting the recently characterized cholesterol efflux tunnel. These results reveal functional defects in NPC1 WT-V and highlight the strength of simulations and quantitative imaging upon stable protein expression in elucidating subtle differences in protein function.
Subject: cholesterol transport
Niemann-Pick C1
lysosomal storage diseases
late endosomes
lipid droplets
gene variants


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record