A histochemical double staining protocol for GABA-α2 and CAMKII in hippocampal neurons using PGC-1α transgenic mice as an example

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202009164115
Title: A histochemical double staining protocol for GABA-α2 and CAMKII in hippocampal neurons using PGC-1α transgenic mice as an example
Author: Koivisto, Maria
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Medicine
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202009164115
http://hdl.handle.net/10138/319404
Thesis level: master's thesis
Abstract: Immunohistochemistry (IHC) is a widely used research tool for detecting antigens and can be used in medical and biochemical research. The co-localization of two separate proteins is sometimes crucial for analysis, requiring a double staining. This comes with a number of challenges since staining results depend on the pre-treatment of samples, host-species where the antibody was raised and spectral differentiation of the two proteins. In this study, the proteins GABAR-α2 and CAMKII were stained simultaneously to study the expression of the GABA receptor in hippocampal pyramidal cells. This was performed in PGC-1α transgenic mice, possibly expressing GABAR-α2 excessively compared to wildtype mice. Staining optimization was performed regarding primary and secondary antibody concentration, section thickness, antigen retrieval and detergent. Double staining was performed successfully and proteins of interest were visualized using a confocal microscope after which image analyses were performed using two different methods: 1) a traditional image analysis based on intensity and density of stained dots and 2) a novel convolutional neural network (CNN) machine learning approach. The traditional image analysis did not detect any differences in the stained brain slices, whereas the CNN model showed an accuracy of 72% in categorizing the images correctly as transgenic/wildtype brain slices. The results from the CNN model imply that GABAR-α2 is expressed differently in PGC-1α transgenic mice, which might impact other factors such as behaviour and learning. This protocol and the novel method of using CNN as an image analysis tool can be of future help when performing IHC analysis on brain neuronal studies.Immunohistokemi (IHC) är en metod för undersökning av antigener som används inom medicinsk och biokemisk forskning. Ibland krävs en dubbelfärgning av två separata protein för att klarlägga co-lokalisering. Detta innebär utmaningar eftersom färgningsresultaten beror på ett flertal faktorer, bland annat förbehandling av sampel, värdorganismen där antikropparna odlats och separering av de färgade proteinernas spektra under mikroskop. I denna studie dubbelfärgades proteinen GABAR-α2 och CAMKII simultant för att klarlägga hur dessa protein uttrycks i GABA receptorer i pyramidalceller belägna i hippocampus. Färgningen gjordes hos PGC-1α möss som eventuellt uppvisar en förhöjd expression av GABAR-α2 jämfört med möss av vildtyp. En optimering av dubbelfärgning gjordes beträffande primära och sekundära antikroppskoncentrationer, tjocklek av vävnadssampel, epitop-demaskering och detergenter. De färgade proteinen gjordes därefter synliga med ett konfokalt mikroskop och två olika bildanalyser genomfördes med olika metoder: 1) en traditionell bildanalys baserat på intensiteten och tätheten av färgade områden samt 2) en nyare maskininlärningsmetod baserad på djupa faltningsnätverk (CNN). Den traditionella bildanalysen hittade inga skillnader mellan de transgena mössens och kontrollgruppens vävnadssampel, medan CNN modellen lärde sig att kategorisera bilderna korrekt i respektive grupp (transgen/vildtyp) med en 72% noggrannhet. Resultaten från CNN modellen tyder på att GABAR-α2 uttrycks olika i de transgena mössen jämfört med vildtypen. Detta kan eventuellt påverka betéendemässiga faktorer och inlärning. Detta protokoll samt den beskrivna maskininlärningsmodellen kan vara till hjälp i framtida IHC forskning av neuroner.
Subject: Immunohistochemistry
IHC
double-staining
GABA-α2
CAMKII
PGC-1α
machine learning
convolutional neural network
CNN


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Koivisto_Maria_Pro_gradu_2020.pdf 2.525Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record