Genome-wide DNA methylation profiling of Ewing sarcoma cell line and patient tumour samples by microarray technology

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012094814
Title: Genome-wide DNA methylation profiling of Ewing sarcoma cell line and patient tumour samples by microarray technology
Author: Koivumaa, Minna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2020
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202012094814
http://hdl.handle.net/10138/322565
Thesis level: master's thesis
Discipline: perinnöllisyystiede
Genetics
genetik
Abstract: Tiivistelmä – Referat – Abstract Ewing sarkooma on harvinainen luu- ja pehmytkudos syöpä, jota esiintyy lähinnä lapsilla ja nuorilla aikuisilla. Luonteeltaan se on aggressiivinen syöpä. Ewing sarkooma perheen kasvaimien hoitoon kuuluu ensisijaisesti leikkaus, säteilyhoito ja kemoterapia. Ewing sarkooma perheen kasvaimien hoito-ohjeet riippuvat siitä, löytyykö kasvaimien etäpesäkkeitä diagnoosihetkellä. Paikallisten kasvainten hoidossa potilaiden viisivuotinen eloonjäämisaste on noussut 50 prosentista 70 prosenttiin. Potilailla, joilla löydetään kasvaimen etäpesäkkeitä diagnoosihetkellä tai on uusiutuva tauti, viisivuotinen eloonjäämisaste on edelleen vain 25 prosenttia. Koska nykyiset hoitovaihtoehdot ovat saavuttaneet jo rajansa, on kehittyneempien hoitomuotojen kehittäminen tärkeää. DNA: n metylaatio on epigeneettinen tapahtuma, joka vaikuttaa geenin ilmentymiseen. Vertaamalla Ewing sarkooma perheen kasvaimien syöpäsolujen geenien promoottorialueiden DNA:n metylaatiotasoa normaalin solun geenien promoottorialueiden DNA:n metylaatiotasoon voisi olla mahdollista löytää geenejä ja signaalireittejä, jotka ovat tärkeitä Ewing sarkooma perheen kasvaimien synnyssä ja ne voisivat olla myös mahdollisia lääkekohdemolekyylejä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on määrittää koko genomin laajuisesti geenien promoottorialueiden DNA:n metylaatiotaso Ewing sarkooma solulinjanäytteissä ja Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteissä verrattuna normaaliin referenssinäytteeseen. Lisäksi tavoitteena on löytää geenien promoottorialueita, jotka ovat eri tavoin metyloituneita Ewing sarkooma solulinjanäytteissä ja Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteissä verrattuna normaaliin referenssinäytteeseen. Materiaalit ja menetelmät Ewing sarkooma solulinjanäytteet (12 kpl) saatiin Laboratory of Oncologi Research, Instituti Ortopedici Rizzoli, Bolognasta, Italiasta. Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteet olivat eristettyjä DNA näytteitä valmiiksi Suomessa. Normaali referenssinäyte oli kaupallinen mesenkyymaalinen solulinja. Ewing sarkooma solulinjanäytteistä ja normaalista referenssinäytteestä DNA eristettiin fenoli-kloroformi menetelmällä. Näytteiden geenien promoottorialueiden DNA:n metylaatiotason mittaus suoritettiin yhdistämällä MeDIP (methylated DNA immunoprecipitation) protokolla Agilent Technologies yhtiön 2-set promoottori mikrosirujen hybridisaatioon. Mikrosirujen hybridisaatiossa saatu tieto DNA:n metylaatiotasosta normalisoitiin ja esikäsiteltiin Agilent Technologies yhtiön Feature Extraction -ohjelmalla. DNA:n metylaatiotaso tietojen visualisointi suoritettiin käyttämällä CSC:n Chipster-analyysi ohjelmistoa. Jokaisen näytetyypin, solulinja-, kasvain- ja referenssinäytteen, jokaiselle geenin promoottorialueelle laskettiin log2ratio arvo, joka kuvasti geenin promoottorialueen metylaatiotasoa. Jotta saataisiin selville eri tavalla metyloituneita geenien promoottorialueita, jokaiselle geenin promoottorialueelle laskettiin log2ratio arvon muutos (=log2 fold change value) sekä Ewing sarkooma solulinjanäytteiden ja normaalin referenssinäytteen välille, että Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteiden ja normaalin referenssinäytteen välille. Log2ratio arvon muutos laskettiin myös Ewing sarkooma solulinjojen ja Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteiden välille. Tämän jälkeen t-testi suoritettiin selvittämään log2ratio arvon muutoksien tilastollista merkitystä. Koko genomin laajuisen geenien promoottorialueiden DNA metylaatiotason määrittäminen Ewing sarkooma solulinjoista ja Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteistä verrattuna normaaliin referenssinäytteeseen suoritettiin laskemalla keskiarvo log2ratio arvojen muutoksista. Samaa laskukaavaa käytettiin selvitettäessä koko genomin laajuisen geenien promoottorialueiden DNA metylaatiotason muutos Ewing sarkooma solulinjanäytteissäverrattuna potilas kasvainnäytteisiin Tulokset Geenien promoottorialueiden DNA:n metylaatiotasoissa Ewing sarkooma solulinjojen, Ewing sarkooma potilas kasvainnäytteiden ja normaalin referenssinäytteen välillä löytyi eroja. Genomin laajuinen geenien promoottorien DNA metylaatiotason mittaus osoitti, että Ewing sarkooma solulinjoissa oli enemmän metylaatiota geenien promoottorialueilla kuin potilas kasvainnäytteissä ja normaalissa referenssinäytteessä. Potilas kasvainnäytteissä oli vähiten geenien promoottorialueiden metylaatiota verrattuna Ewing sarkooma solulinjoihin ja normaaliin referenssinäytteeseen. Eri tavalla metyloituneita geenien promoottorialueita oli Ewing sarkooma solulinjanäytteissä verrattuna normaaliin referenssinäytteeseen 16 kappaletta. Myös potilas kasvainnäytteissä havaittiin 16 eri tavalla metyloitunutta geenin promoottorialuetta verrattuna referenssinäytteeseen. Eri tavalla metyloituneita geenien promoottorialueita oli Ewing sarkooma solulinjojen ja potilas kasvainnäytteiden välillä 56.Tiivistelmä – Referat – Abstract Ewing sarcoma is a rare bone and soft tissues cancer that occurs mainly among children and young adults. It is an aggressive cancer. Treatment of Ewing Sarcoma Family of Tumours (ESFT) primarily includes surgery, radiation and chemotherapy. The treatment protocol depends on the presence of tumour metastases at the time of diagnosis. In the treatment of local tumours, the 5-year patient survival rate has increased from 50% to 70%. However, patients that have tumour metastases at the time of the diagnosis or have a recurrent disease, the five-year survival rate is only 25%. As the current treatment options have reached their limits, it is important to develop more advanced therapies. DNA methylation is an epigenetic event that affects gene expression. By comparing the methylation level of the DNA in gene promoter regions in ESFT cancer cells to the methylation level of DNA in gene promoter regions in normal cells it could be possible to discover genes and signalling pathways that are important in the development of ESFT and that could be potential drug target molecules. The aim of this study is to find out the genome-wide gene promoter DNA methylation status in Ewing sarcoma cell line samples and Ewing sarcoma patient tumour samples compared to a normal reference sample. Another aim is to find gene promoter regions that are differentially methylated in the Ewing sarcoma cell line samples and the Ewing sarcoma patient tumour samples compared to the normal reference sample. Materials and Methods The Ewing Sarcoma cell line samples (12) were obtained from the Laboratory of Oncologi Research, Instituti Ortopedici Rizzoli Laboratory, Bologna, Italy. The Ewing sarcoma patient tumour samples were pre-isolated DNA samples already in Finland. The normal reference sample was a commercial mesenchymal cell line sample. From the Ewing Sarcoma cell line samples and the normal reference sample, DNA isolation was done by using phenol-chloroform method. DNA methylation profiling of the samples was performed by combining MeDIP (methylated DNA immunoprecipitation) protocol with 2-set promoter microarray hybridization protocol provided by Agilent Tecnologies company. DNA methylation data that was received from the microarrays was normalized and pre-processed with the Feature Extraction software provided also by the Agilent Technologies company. Visualization of the DNA methylation data was performed by using Chipster analysis software provided by CSC. To measure the level of DNA methylation at the gene promoter regions, a log2ratio value was calculated for every gene promoter region in all the sample types. To find gene promoter regions that were differently methylated, a log2 fold change value was calculated from the log2ratio values between the Ewing Sarcoma cell line cancer samples and the normal reference sample and between the Ewing sarcoma patient tumor samples and the normal reference sample for each gene promoter region. The log2 fold change value was also calculated between the Ewing Sarcoma cell line cancer samples and the Ewing Sarcoma patient tumor samples. After this a t-test was performed to determine the statistical significance of the log2 fold change values. Detection of genome-wide DNA methylation levels at the gene promoter regions in the Ewing sarcoma cell line samples and the Ewing sarcoma patient tumour samples compared to the normal reference sample was performed by averaging log2 fold change values. The same calculation method was used to detect the differences in the genome-wide DNA methylation levels at the gene promoter regions between the Ewing sarcoma cell lines and the Ewing Sarcoma patient tumour samples. Results Differences in the DNA methylation levels at the gene promoter regions were detected between the Ewing Sarcoma cell line samples, patient tumour samples, and the normal reference sample. Genome-wide measurement of the DNA methylation levels at the gene promoter areas showed that the Ewing sarcoma cell lines had more DNA methylation at the gene promoter regions than the patient tumour samples and the normal reference sample. The patient tumour samples showed less DNA methylation at the gene promoter regions compared to the Ewing sarcoma cell lines and the normal reference sample. Differentially methylated gene promoter regions between the Ewing sarcoma cell lines and the reference sample were found 16. In the patient tumour samples, also 16 differently methylated gene promoter regions were found compared to the normal reference sample. Differentially methylated gene promoter regions between the Ewing sarcoma cell lines and the patient tumour samples were 56.
Subject: Cancer
Ewing sarcoma
DNA methylation


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Koivumaa_Minna_tutkielma_2020.pdf 1.146Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record