Bivalent promoters in myometrium and uterine leiomyoma

Abstract

Leiomyoomat ovat hyvänlaatuisia kohdun sileän lihaskudoksen kasvaimia, joita esiintyy jopa 80%:lla lisääntymisikäisistä naisista. Leiomyoomat aiheuttavat lukuisia oireita, joiden lisäksi ne ovat maailmanlaajuisesti yleisin syy kohdunpoistoihin sekä aiheuttavat merkittävää taloudellista kuormitusta.

Bivalentit promoottorit ovat geenin säätelyalueita, joissa esiintyy samanaikaisesti H3K4me3- ja H3K27me3-histonimodifikaatioita. Erikseen esiintyessään näillä histonimodifikaatioilla on vastakkaiset vaikutukset geenin aktiivisuuteen. Yhdessä ne pitävät bivalentit geenit tilapäisesti hiljennettyinä tai matala-asteisesti ekspressoituneina sekä mahdollistavat nopeat muutokset geenin transkriptiostatuksessa vasteena ulkoisiin signaaleihin. Bivalentin kromatiinin merkitys tuumorigeneesissä ja solujen erilaistumisessa on korostunut uusimmissa tutkimuksissa. Toistaiseksi valtaosa tutkimuksesta on kuitenkin keskittynyt solulinjoihin.

Tutkielman tarkoituksena oli selvittää bivalenttien promoottorien genominen sijainti leiomyoomissa ja myometriumissa. Lisäksi tutkielmassa pyrittiin tarkastelemaan bivalenttien promoottorien biologista merkitystä geenien ontologisen analyysin avulla. Näin ollen tutkielmassa tuotettu data selventää bivalentin kromatiinin jakautumista ihmiskudoksessa sekä sen mahdollista osallisuutta kasvainten syntymiseen.

Kromatiini-immunopresipitaatio-tekniikka mahdollisti H3K4me3- ja H3K27me3 -histonimodifikaatioiden paikannuksen syväjäädytetyistä leiomyoomakasvaimista sekä vastaavasta kohdun normaalikudoksesta. Promoottori määritettiin bivalentiksi, jos molempien histonimodifikaatioiden päällekkäisyyksiä löytyi 2 kb:n säteeltä geenin transkription aloituskohdasta kaikissa kudostyyppikohtaisissa näytteissä.

Yhteensä 951 geenillä määritettiin olevan bivalentti promoottori. Vain 231 (24.3%) näistä bivalenteistä geeneistä esiintyi molemmissa kudostyypeissä suurimman osan ollessa kudostyyppikohtaisia. Nämä löydökset osoittivat bivalenttien promoottorien säätelevän huomattavaa määrää geenejä erilaistuneessa kudoksessa sekä bivalenttien geenijoukkojen eroavan merkittävästi leiomyoomien ja myometriumin välillä viitaten bivalentin kromatiinin osallisuuteen kasvainten synnyssä. Bivalenttien geenien ontologinen analyysi osoitti odotetusti suurimman osan myometriumin bivalenteistä promoottoreista säätelevän geenejä, joilla on kehityksellisiä tehtäviä, kun taas kantasolujen erilaistumiseen liittyvät prosessit rikastuivat leiomyoomakohtaisissa bivalenteissä geeneissä. Jatkotutkimuksia kuitenkin vaaditaan bivalentin kromatiinin ja leimyoomien välisen yhteyden tarkempien mekanismien selvittämiseksi.

Uterine leiomyomas are benign tumors originating in the smooth muscle cells of the uterine wall. Leiomyomas represent one of the most common tumor types in women affecting up to 80% of pre-menopausal women. Besides having extensive implications on women´s health through the numerous symptoms they cause, leiomyomas are a cause of remarkable financial burden worldwide.

Bivalent promoters are defined by the co-occurrence of two histone modifications with opposite functions: trimethylation of lysine 4 on histone 3 (H3K4me3) and trimethylation of lysine 27 on histone 3 (H3K27me3). H3K4me3 is associated with promoters of actively expressed genes, whereas H3K27me3 is frequently found at promoters of silenced genes. The genes controlled by the bivalent promoters are reversibly silenced or expressed at low levels and remain poised for fast activation or full repression as a response to external cues. Bivalent chromatin is gaining more and more importance as new roles are identified in tumorigenesis and cell differentiation. Despite this, the vast majority of data available was obtained from cell lines, and not from human tissue.

The aim of this thesis work was to map the genomic location of bivalent promoters in uterine leiomyoma and myometrium tissue, and to characterize the functions of bivalently-controlled genes in differentiated tissue. This would provide novel information about bivalent promoters’ distribution in human tissues and also their potential role in myomagenesis.

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) against H3K4me3 and H3K27me3 was performed on fresh frozen tissue samples of uterine leiomyomas and corresponding myometrium. A promoter was defined as bivalent, if it showed overlap between H3K4me3 and H3K27me3 peaks within a 2 kb region of a gene’s transcription start site in all samples.

Altogether 951 bivalent promoters were found in myometrium and leiomyoma. Strikingly, only 231 (24.3%) promoters were present in both tissue types, most bivalent promoters being tissue-specific. These findings indicated bivalent promoters regulating a substantial number of genes also in differentiated tissue and the presence of extensive alterations in bivalent promoter distribution during myomagenesis. Gene ontology analyses of the bivalently-controlled genes in myometrium revealed the highest score for developmental processes. Instead, for leiomyomas, the highest enrichment was detected in stem cell fate specification-related processes.

The data presented in this thesis suggests that bivalent chromatin plays an important role during myomagenesis, as it undergoes a significant reorganization during the process. Future experiments will provide novel insights about the role for these changes, i.e.: if they underlie the process.