Expression and purification of inositol requiring enzyme 1 (IRE1)

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202106032483
Title: Expression and purification of inositol requiring enzyme 1 (IRE1)
Author: Taha, Lamia
Other contributor: Helsingin yliopisto, Bio- ja ympäristötieteellinen tiedekunta
University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences
Helsingfors universitet, Bio- och miljövetenskapliga fakulteten
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202106032483
http://hdl.handle.net/10138/330563
Thesis level: master's thesis
Degree program: Genetiikan ja molekulaaristen biotieteiden maisteriohjelma
Master's Programme in Genetics and Molecular Biosciences
Magisterprogrammet i genetik och molekylära biovetenskaper
Specialisation: Biokemia ja rakennebiologia
Biochemistry and Structural biology
Biokemi och strukturbiologi
Abstract: Endoplasminen retikkeli (ER) on tärkeä organelli solulle, missä suuri määrä proteiineja syntetisoidaan ja muokataan lopulliseen toiminnalliseen muotoonsa. Tämän takia ER:in stressiä, joka johtuu väärin laskostuneiden proteiinien kerääntymisestä ER:iin, ei pidä ottaa kevyesti, koska se voi vaikuttaa moniin sairauksiin, kuten syöpään ja eri neurodegeneratiivisiin sairauksiin. Täten laskostumattomien proteiinienvaste (UPR) on mukautuva järjestelmä, joka auttaa ER:ia sopeutumaan lisääntyneeseen laskostumistarpeeseen. Yksi vasteen pääproteiineista on inositolia vaativa entsyymi 1 (IRE1). IRE1 havaitsee proteiinien laskostumisen tilan ER:issa ja käynnistää UPR-signalointireitin, jotta saavutetaan joko normaali laskostumistila tai solukuolema. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tuottaa hiivan IRE1 proteiinia E.colissa ja ihmisen IRE1 hyönteissoluissa, puhdistaa proteiini affiniteettikromatografialla ja tutkia sen kiderakennetta pienen molekyylimodulaattorin kanssa, joka voisi mahdollisesti tehostaa sen toimintaa. Proteiini tuotettiin onnistuneesti ja puhdistettiin glutationi-S-transferaasi (GST)-merkinnän avulla ja eristetyn proteiinin aktiivisuus määritettiin. Rakenteellisia tutkimuksia ei suoritettu, koska kiteytymiseen tarvittavaa absoluuttista puhtautta ja saantoa ei saavutettu johtuen proteiinin menetyksestä geelisuodatuksen aikana ja saostumisen takia. Tulosten perusteella on todennäköistä, että proteiinin rakenne voitaisiin ratkaista ja biokemialliset ja rakenteelliset tutkimukset F10:llä ovat erittäin mahdollisia.The endoplasmic reticulum (ER) is an important organelle of the cell where a high number of proteins are synthesized and modified to obtain their final structure. Therefore, the ER stress, which is caused by accumulation of unfolded proteins in the ER, is not to be taken lightly since it could contribute to many diseases, such as cancer and neurodegenerative diseases. The response to the ER stress is the unfolded protein response (UPR), which is an adaptive system that helps in adjusting for increased folding needs within the ER. One of the main protein branches in the UPR is inositol requiring enzyme 1 (IRE1). IRE1 detects the status of protein folding inside the ER and initiates the UPR signaling pathway to achieve either normal folding status or cell death. The aim of this research was to express yeast IRE1 in E.coli and human IRE1 in insect cells, purify with affinity chromatography and study the IRE1’s crystal structure with a small molecule modulator that could possibly enhance its activity. The protein was expressed successfully and purified with glutathione S-transferase (GST) tag, and the activity of the pure protein was determined. The structural studies were not fully completed since the absolute purity and yield that was necessary for crystallization was not achieved due to loss of protein during gel filtration and precipitation. Based on the results it is likely that the structure of the protein could be solved and further biochemical and structural studies with F10 are possible.
Subject: ER
ER stress
IRE1
expression
purification
protein
GST


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Taha_Lamia_Pro_Gradu_2021.pdf 1.178Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record