Novel split intein-mediated selection of cells containing multiple different plasmids using a single antibiotic

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202106183179
Title: Novel split intein-mediated selection of cells containing multiple different plasmids using a single antibiotic
Author: Johansson, Julia
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021
Language: eng
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-202106183179
http://hdl.handle.net/10138/331522
Thesis level: master's thesis
Degree program: Mikrobiologian ja mikrobibiotekniikan maisteriohjelma
Master's Programme in Microbiology and Microbial Biotechnology
Magisterprogrammet i mikrobiologi och mikrobibioteknik
Specialisation: ei opintosuuntaa
no specialization
ingen studieinriktning
Abstract: Tämän tutkielman tavoitteena on kehittää uudenlainen toimintamalli täsmällisten aktiivisuuksien omaavien solujen valikointiin hyödyntäen proteiinien alayksiköiden vaihtoehtoista liittämistä toisiinsa. Proteiinien alayksiköiden vaihtoehtoinen liittäminen, toisin sanoen silmukointi, on ilmiö, joka tapahtuu solujen sisällä spontaanisti. Reaktioita katalysoivat inteiinit, jotka liittävät yhteen C-terminaalisen ja N-terminaalisen eksteiini-osan peptidisidoksella. C-terminaalisesta ja N-terminaalisesta osasta koostuvan katkaistun proteiinin aktiivisuus voidaan palauttaa inteiinin irti kuroutumisen jälkeen. Tätä tapahtumaa voidaan hyödyntää solujen valikoinnissa erilaisten aktivisuuksien, kuten antibioottiresistenssin, tutkimisessa. Tämän projektin tarkoituksena on liittää inteiini antibioottiresistenssigeeniin, jonka avulla voidaan säädellä geenin ja siitä tuotettavan proteiinin aktiivisuutta proteiinin alayksiköiden vaihtoehtoisen liittämisen avulla. Tämän menetelmän avulla voidaan valita solut, jotka ilmentävät kahta toisiaan täydentävää plasmidia. Solut, jotka ilmentävät toisiaan täydentäviä plasmideja, kykenevät palauttamaan antibioottiresistenssin. Menetelmä perustuu inteiinin liittämiseen antibioottiresistenssigeeniin, jonka seurauksena proteiini on inaktiivinen. Kloonauksen avulla tuotetaan kaksi plasmidia, jotka sisältävät inteiinin sekvenssin kokonaisuudessaan. Toisen plasmidin sekvenssi sisältää deleetion inteiinissä, toinen plasmidi sisältää puolestaan deleetiota vastaavan sekvenssin. Tuomalla nämä kaksi plasmidia samaan bakteerisoluun transformaation avulla, voidaan inteiinin aktiivisuus ja siten antibioottiresistenssigeenin aktiivisuus palauttaa. Tätä menetelmää voitaisiin käyttää solujen valinnassa sillä vain solut, jotka ilmentävät kumpaakin plasmidia, kykenevät palauttamaan antibioottiresistenssin ja kasvavat siten antibioottia sisältävällä maljalla.This project focuses on development of novel split intein systems for selection of biological activities utilizing protein splicing. Protein splicing is phenomenon that occurs naturally inside the cell and the reaction is catalyzed by inteins, which connect C-terminal and N-terminal exteins with a peptide bond. The activity of the interrupted protein, consisting the exteins, can be restored after the intein is excised and the peptide bond links the exteins together. This occurrence can be used for selection of cells based on different activities including antibiotic resistance. The project aims to insert an intein in antibiotic resistance gene which could allow controlling the protein activity of the antibiotic resistance gene by protein splitting. This method is based on inserting an intein to the antibiotic resistance conferring enzyme which makes the protein inactive. Creating two separate plasmids that include the intein sequence can be transformed into bacterial cells. Other plasmid includes a deletion in the intein sequence and the cells that include this plasmid only, are not able to survive in the presence of an antibiotic. This is due to inactivity of the intein and thus the inactivity of the enzyme that confers the resistance. Incorporating a second plasmid that includes the corresponding sequence to the deletion, the intein activity can be recovered and thus the protein activity. By this method with cotransformation, both plasmids are transformed simultaneously which recovers the intein activity and further the antibiotic resistance. This could be used for the cell selection since only the cells that harbor both of the two complementary plasmids could restore the antibiotic resistance.
Subject: protein splicing
intein-mediated cell selection
transformation
antibiotic resistance


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record