Modification and development of probiotic strains Saccharomyces boulardii CNCM I-745 and Lacticaseibacillus rhamnosus GG

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7574-8
Title: Modification and development of probiotic strains Saccharomyces boulardii CNCM I-745 and Lacticaseibacillus rhamnosus GG
Author: Li, Ran
Other contributor: Helsingin yliopisto, maatalous-metsätieteellinen tiedekunta
Helsingfors universitet, agrikultur-forstvetenskapliga fakulteten
University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry
Mikrobiologian ja biotekniikan tohtoriohjelma
Doktorandprogrammet i mikrobiologi och bioteknik
Doctoral Programme in Microbiology and Biotechnology
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2021-10-22
Language: en
Belongs to series: Dissertationes Schola Doctoralis Scientiae Circumiectalis, Alimentariae, Biologicae - URN:ISSN:2342-5431
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-7574-8
http://hdl.handle.net/10138/334770
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Probiotics are defined as “live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”. In this doctoral dissertation, probiotic strains Saccharomyces boulardii CNCM I-745 and Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) were developed as next-generation probiotics. The constructed S. boulardii strains, i.e., SAC4 based on the wild-type S. boulardii CNCM I-745 and SAC12 based on the URA3 auxotrophic derivative, secreted bacteriocin leucocin C, which showed inhibitory activity against the foodborne pathogen Listeria monocytogenes. Interestingly, the leucocin C secretion ability of S. boulardii SAC12 was stronger than that of SAC4. S. boulardii SAC4 killed L. monocytogenes effectively when cells of yeast and Listeria were incubated together without selection pressure, demonstrating the potential of cell mediated inhibition instead of using concentrated supernatant. Beer fermented with SAC12 was evaluated to be efficient in Listeria decontamination of chicken breast strips, with the maximum reduction of 2.2 log units from (1.8±0.3) × 10^5 CFU/g. LGG is one of the most studied probiotic strains, and it has been commercially used as a probiotic supplement in dairy products. The challenge of using LGG in dairy products is that it cannot metabolize the lactose and casein of milk, thus causing its poor growth in milk. We aimed to abolish this deficiency of LGG by bacterial conjugation, a non-GMO method. The dairy strain Lactococcus lactis NCDO 712 was used as donor, as it carries the plasmid pLP712 with the gene encoding the protease for casein degradation as well as the gene for lactose catabolism. In this study, a successful conjugation was done between L. lactis NCDO 712 and LGG. The plasmid pLP712 was conjugated into LGG, verified by plasmid-specific PCR and plasmid DNA isolation. The transconjugant L. rhamnosus LAB49 showed a clear ability of lactose utilization on indicator plate, in which lactose was the only carbon source. LAB49 was incubated in MRS, and all tested colonies (n= 80) lost their lactose-fermenting ability after 100 generations. The proteolytic activity of LAB49 was analyzed by SDS-PAGE and it showed that β-casein was fully digested in 4 h by LAB49 and NCDO 712 but not at all by LGG. The growth curve indicated that LAB49 grew well in milk, reaching stationary phase in 11 to 12 h after inoculation. These results collectively suggested that, L. rhamnosus LAB49, an upgraded food-grade and non-GMO derivative of LGG had been generated.Probiootit ovat eläviä mikrobeja, jotka riittävissä määrin syötyinä vaikuttavat terveyteen myönteisellä tavalla. Tässä väitöskirjatutkimuksessa kehitettiin terveyttä edistävistä Saccharomyces boulardii CNCM I-745 ja Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) mikrobikannoista ns. uuden sukupolven probiootteja. S. boulardii CNCM I-745 on probioottinen hiivakanta, joka estää bakteerien haitallisia vaikutuksia suolistossa. Tässä työssä sekä S. boulardii CNCM I-745 villityyppi että auksotrofinen URA3 –mutantti saatiin erittämään leukosiini C –nimistä bakteriosiinia, joka on tehokas estämään patogeenisen Listeria monocytogenes –bakteerin kasvua. URA3-mutantti-pohjaisen SAC12-kannan havaittiin olevan tehokkaampi leukosiinin erittäjä kuin villityyppiin perustuvan SAC4-kannan. S. boulardii SAC4 –kanta tappoi Listeriaa tehokkaasti, kun Listeria- ja hiivasoluja inkuboitiin yhdessä. Tämä koejärjestely osoitti nimenomaan soluvälitteisen inhibition olevan tehokasta kasvatusliemen sijaan. S. boulardii SAC12 –kannalla valmistettiin olutta, jolla marinoitiin Listerialla kontaminoituja kananrintasuikaleita. Olutmarinadi vähensi tehokkaasti Listeria-määriä kananrintasuikaleissa. LGG on maailman tutkituimpia probioottisia maitohappobakteerikantoja, ja sitä käytetään probioottisena lisänä monissa kaupallisissa maitopohjaisissa tuotteissa. LGG ei kuitenkaan hajota maitosokeri laktoosia eikä maitoproteiini kaseiinia, eikä se siksi pysty kasvamaan maidossa. Tässä työssä nämä puutteet korjattiin bakteerien konjugaation avulla, koska konjugaatiota pidetään ns. non-GMO -geeninsiirtomenetelmänä. Laktoosin ja kaseiinin hajotukseen tarvittavat geenit saatiin juustohapatebakteeri Lactococcus lactis NCDO 712 –kannan pLP712-plasmidista. LGG ja L. lactis NCDO 712 saatiin konjugoitumaan, jolloin plasmidi pLP712 siirtyi laktokokista LGG:hen. DNA:n siirtyminen varmistettiin PCR:llä ja plasmidieristyksellä. Transkonjuganttikanta L. rhamnosus LAB49 hajotti laktoosia kasvatusmaljalla, jossa laktoosi oli ainoa hiilenlähde kasvulle. Kun LAB49-kantaa kasvatettiin 100 sukupolvea ilman laktoosin tuottamaa selektiopainetta, se menetti laktoosinkäyttökykynsä, mikä johtui plasmidin pLP712 rakenteellisesta epävakaudesta. LAB49-kannan proteolyyttinen aktiivisuus varmistettiin SDS-PAGE-geelissä, mikä osoitti LAB49:n hajottavan kaseiinin täydellisesti neljässä tunnissa. Näiden LAB49-kannan uusien ominaisuuksien vaikutus kykyyn kasvaa maidossa testattiin vertaamalla kasvua LGG-kannan kanssa. Toisin kuin LGG, joka ei kasvanut maidossa, LAB49 kasvoi hyvin, ja saavutti stationäärivaiheen noin 12 tunnissa. LAB49-kantaa voidaan pitää ei-geneettisesti-muunneltuna elintarvikekelpoisena paranneltuna LGG-versiona, jota voitaisiin käyttää hapatteena maitotuotteissa.
Subject: microbiology
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
li_ran_dissertation_2021.pdf 856.8Kb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record