Myofibril-bound calpains : Mechanisms on degradation of myofibrillar proteins and meat tenderization

Abstract

The aim of the thesis was to investigate the mechanisms of myofibril-bound calpains on the degradation of myofibrillar proteins and meat tenderization postmortem.

The role of Ca2+ in the process of calpain-2 becoming bound to the myofibrils isolated from 12-h porcine longissimus thoracis (LT) muscles and the activity of myofibril-bound calpains were investigated. There were calpains bound to isolated myofibrils and the myofibril-bound calpains were active when sufficient Ca2+ presented. Calpain-2 can become relatively tightly bound to myofibrils, a process which was induced by Ca2+. The binding of calpain-2 to isolated myofibrils occurred in a Ca2+ concentration-dependent manner. After the binding, the myofibril-bound calpain-2 was active and thus able to degrade desmin.

In the pork stored at 2 °C for 1, 3, 6, 9 and 12 days, the content of sarcoplasmic calpain-1 declined, while the myofibril-bound calpain-1 content increased until day 6 followed by a decrease with later storage. The results suggest that calpain-1 translocates from sarcoplasm to myofibrils early postmortem. Desmin in isolated myofibrils was degraded by myofibril-bound calpains upon incubation with Ca2+ in the order of 5 mM > 0.05 mM > 0. Ca2+ titration curves indicated that myofibrils contain two distinct activities corresponding to the known Ca2+ requirements for calpain-1 and -2, respectively. The results suggest that both calpain-1 and calpain-2 will be bound to myofibrils postmortem and then degrade desmin.

The effects of pre-rigor temperature on calpain-1 distribution between sarcoplasm and myofibrils and calpain activity were investigated by incubating pre-rigor pork at 14, 22, 30 or 38 °C for 6 h followed by 2 h incubation at 14 °C and then storage for 1 or 4 days at 2 °C. The free Ca2+ level, the translocation of calpain-1 from sarcoplasm to myofibrils and protein degradation increased significantly early postmortem with increased pre-rigor temperature. However, calpain-1 lost its activity in muscle at 38 °C. Declined water-holding capacity (WHC) of myofibrils and increased purge loss were observed with increased temperature. WHC of myofibrils, degradation of desmin and troponin T, and myofibril fragmentation increased after incubation of myofibrils with Ca2+, indicating that proteolysis caused by myofibril-bound calpains has potential to improve WHC of myofibrils.

In conclusion, the results of the current thesis suggest that Ca2+ induces both calpain-1 and calpain-2 to bind to myofibrils in a concentration-dependent manner. Calpains gradually translocate from the sarcoplasm to myofibrils postmortem and the translocation will be accelerated by an increased pre-rigor temperature. The myofibril-bound calpains are active in the presence of Ca2+ and thereby leading to meat tenderization.

Opinnäytetyössä tutkittiin lihan rakenneproteiineihin sitoutuneiden entsyymien, kalpaiini-1:n ja kalpaiini-2:n, vaikutuksia rakenneproteiinien hajoamiseen ja lihan mureutumiseen.

Työssä tutkittiin kalsiumpitoisuuden vaikutusta kalpaiini-2:n sitoutumiseen sian selkälihaksista rakenneproteiineihin (myofibrilleihin) ja sitoutuneiden kalpaiinien proteiineja hajotusaktiivisuuteen. Kalpaiini-2 sitoutui myofibrilleihin sitä paremmin, mitä korkeampi kalsiumpitoisuus lihaksessa on. Sitoutunut kalpaiini-2 oli proteolyyttisesti aktiivinen ja kykeni hajottamaan rakenneproteiineja.

Sian selkälihaksissa, joita säilytettiin 2 °C:ssa 1, 3, 6, 9 ja 12 vuorokautta, solunesteen vapaan kalpaiini-1-pitoisuuden havaittiin laskevan, kun taas myofibrilliin sitoutuneen kalpaiini-1:n pitoisuus nousi 6 vrk asti, mitä seurasi asteittainen väheneminen. Tämä viittaa siihen, että kalpaiini-1 siirtyy vähitellen solunesteestä myofibrilleihin varastoinnin aikana. Myofibrilliin sitoutuneet kalpaiinit hajottivat merkitproteiinia desmiiniä, ja kalsiumtitrauskäyrien mukaan myofibrilleissä on kaksi erillistä proteolyyttistä aktiivisuutta, jotka vastaavat tunnettuja kalpaiini-1:n ja kalpaiini-2:n kalsiumpitoisuusvaatimuksia.

Ennen kuolonkankeutta vallinneen lämpötilan vaikutuksia kalpaiini-1:n jakautumiseen solunesteen ja myofibrillien välillä sekä kalpaiinien aktiivisuutta tutkittiin pitämällä selkälihaksia heti teurastuksen jälkeen 6 tuntia 14, 22, 30 tai 38 °C:ssa, mitä seurasi 2 tunnin varastointi 14 °C:ssa ja sitten 1 tai 4 päivää 2 °C:ssa. Vapaan kalsiumin pitoisuus solunesteessä, kalpaiini-1:n siirtyminen solunesteestä myofibrilleihin ja proteiinien hajoaminen lisääntyivät heti teurastuksen jälkeen olleen säilytyslämpötilan kohotessa. Kalpaiini-1 kuitenkin menetti proteolyyttisen aktiivisuutensa korkeimmassa lämpötilassa (38 °C). Lämpötilan noustessa myofibrillien vedenpidätyskyky pieneni ja lihan nestehukka lisääntyi. Kuitenkin kalsiumpitoisuuden kasvaessa myofibrillien vedenpidätyskyky, rakenneproteiinien hajoaminen ja myofibrillien pilkkoutuminen kasvoivat, mikä osoittaa, että myofibrilliin sitoutuneiden kalpaiinien aiheuttama proteolyysi parantaa veden pidättymistä myofibrilleihin.

Tämän opinnäytetyön tulokset osoittivat kalsiumin saavan kalpaiini-1:n ja kalpaiini-2:n sitoutumaan myofibrilleihin pitoisuusriippuvaisella tavalla. Kalpaiinit siirtyvät vähitellen solunesteestä myofibrilleihin varastoinnin aikana, ja siirtymää kiihdyttävät korkeat lihan lämpötilat heti teurastuksen jälkeen. Myofibrilleihin sitoutuneet kalpaiinit hajottavat myofibrilliproteiineja kalsiumin läsnä ollessa, mikä johtaa lihan mureutumiseen.