Characterization and molecular biology of Daletvirus boae - a founding member of the realm Ribozyviria

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-8372-9
Title: Characterization and molecular biology of Daletvirus boae - a founding member of the realm Ribozyviria
Author: Szirovicza, Leonóra
Other contributor: Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta
Helsingfors universitet, medicinska fakulteten
University of Helsinki, Faculty of Medicine, Department of Virology
Biolääketieteellinen tohtoriohjelma
Doktorandprogrammet i biomedicin
Doctoral Programme in Biomedicine
Publisher: Helsingin yliopisto
Date: 2022-08-01
Language: en
URI: http://urn.fi/URN:ISBN:978-951-51-8372-9
http://hdl.handle.net/10138/346036
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Hepatitis D virus (HDV), first described in 1977, is a peculiar pathogen and the smallest virus known to infect humans. HDV was first identified in liver biopsy samples of chronic hepatitis B virus (HBV) carriers. Soon after, it was recognized as the satellite virus of HBV. The genome of HDV encodes a single protein, the delta antigen (DAg), which exists in two forms (small and large) due to a cellular editing mechanism. The two forms of the protein play a vastly different role in the viral life cycle. As the genome does not encode additional proteins, HDV is fully dependent on cellular factors and its helper virus, which provides the glycoprotein coating necessary for infectious particle formation. For decades, HDV was the sole member of deltaviruses, which were thought to be human-only pathogens. However, in 2018, metatranscriptomic analyses identified various novel HDV-like agents from bird samples by others, and from a snake by us. Following these studies, several HDV-like agents were identified across a wide range of taxa, and in absence of co-infecting HBV. These findings led to the new classification of HDV and all the newly described HDV-like agents into eight different genera within the Kolmioviridae family in the novel realm Ribozyviria (the highest taxonomic rank established for viruses). In this study, Swiss snake colony virus 1 (SwSCV-1), one of the novel HDV like agents, was detected in the brain sample of a Boa constrictor snake with severe central nervous system signs. SwSCV-1 has characteristics that are typical to HDV. It has an approximately 1.7 kilobases long single-stranded RNA genome with ribozymes present in both genomic and antigenomic strands. In addition to the DAg, the sole protein in case of HDV, we identified another potential open reading frame (ORF). To enable in vitro and helper-independent studies of the novel virus, we developed various infectious clones, which allowed us to initiate viral replication upon transfection into snake and mammalian cells. We not only showed that the constructs initiate replication in cell culture, but also achieved persistent SwSCV 1 infection of snake cell lines by passaging of the transfected cells. We found no traces of a co-infecting hepadnavirus during the initial metatranscriptomic analyses, but reptarena- and hartmanivirus reads were present. These findings made us hypothesize the identified pathogens as potential helper viruses of SwSCV-1. We used superinfection studies of the persistently infected snake cell lines to show that SwSCV-1 is indeed able to form infectious particles with the abovementioned viruses. We further showed that transfection of the persistently infected cells with glycoproteins from different virus families (arena- and hantaviruses) is sufficient to induce infectious particle formation. We further generated an infectious clone with an introduced point mutation, abolishing protein expression from the second ORF, to investigate the possible roles of the putative protein. During the studies on the second ORF, we observed that the persistently infected snake cell lines – originally transfected by different constructs – show decreased infectious particle formation ability as compared to freshly transfected cells. This observation and the further experiments conducted led to the finding of SwSCV-1 expressing only the small form of the DAg. These studies provided the first experimental evidence of in vitro replication and infectious nature of SwSCV-1, one of the early representatives of novel kolmiovirids. Furthermore, SwSCV-1 was the first of the novel HDV-like agents that was shown to use various viruses other than HBV for infectious particle production, opening up potential new disease associations. The discovery of numerous novel deltaviruses has shown that despite the extensive knowledge on HDV, the world of these viruses is much more complex than previously thought. In order to gain a better understanding, detailed molecular characterization of the new agents is necessary. This study generated generic molecular tools that are easily adaptable for the novel deltaviruses and the ones that are still to be discovered and will facilitate future research on these unique pathogens.Hepatiitti D virus (HDV), hyvin poikkeuksellinen ja pienin tunnettu ihmisiä infektoiva patogeeni, havaittiin ensimmäisen kerran vuonna 1977. Ensimmäinen havainto HDV:stä tehtiin hepatiitti B virusta (HBV) kroonisesti kantavien potilaiden munuaisbiopsianäytteistä. Pian löytämisen jälkeen HDV:n havaittiin olevan HBV:n satelliittivirus. HDV:lla on yksijuosteinen rinkulamainen 1700 nukleotidin mittainen genomi, joka muodostaa sauvamaisen rakenteen juosteiden keskinäisen pariutumisen ansiosta. HDV:n genomi ohjaa yhden proteiinin, delta antigeenin (DAg) tuottoa. Solun RNA:ta muokkaavien entsyymien ansiosta DAg esiintyy infektoituneessa solussa kahdessa eri muodossa, S- ja L-DAg (englannin sanoista small ja large, pieni ja suuri), joilla on toisistaan poikkeavia tehtäviä viruksen elinkaaren aikana. Viruksen RNA genomissa sekä sille komplementaarisessa antigenomissa on entsymaattisesti aktiivinen nukleotidijakso, ribotsyymi, joka ohjaa viruksen genomin pilkkoutumista yhden genomin kokoisiin palasiin viruksen ”rolling circle” –mekanismilla etenevän replikaation aikana. Koska viruksen genomi ei tiettävästi sisällä muita toiminnallisia alueita, HDV on replikaatiossaan täysin riippuvainen solun koneistosta ja entsyymeistä. Muodostaakseen lopulta infektiivisiä partikkeleita HDV on myös riippuvainen auttajavirus HBV:sta, joka vastaa glykoproteiinien tuotannosta. HDV oli ainoa tunnettu deltavirus vuosikymmenien ajan ja niiden oletettiin olevan ainoastaan ihmisiä infektoivia patogeeneja. Vuonna 2018 löytyi ensin lintujen ulosteista metatranskriptomiikkatutkimusten avulla HDV:n kaltainen virus. Samoihin aikoihin tunnistimme HDV:n kaltaisen viruksen boakäärmeen aivoista. Näiden tutkimusten jälkeen HDV:n kaltaisia viruksia on löytynyt useista eri eläinlajeista, ja poikkeuksetta ilman samanaikaista HBV-infektiota. Näiden uusien virusten löytäminen on johtanut deltavirusten taksonomiseen luokitteluun omiksi suvuikseen uuteen Ribozyviria valtapiiriin (englanniksi realm, korkein virusten taksonominen luokka) kuuluvassa Kolmioviridae-heimossa. Löysimme Swiss snake colony virus 1:n (SwSCV-1:n) vakavista neurologisista oireista kärsineen boakäärmeen aivoista metatranskriptomiikan avulla. SwSCV-1:n genomi on rinkulamainen yksijuosteinen RNA kooltaan noin 1700 nukleotidia. Genomi sisältää DAg:n lisäksi sekä genomisen että antigenomisen ribotsyymin ja toisen avoimen lukuraamin, joka mahdollisesti ohjaa toisen proteiinin tuottoa. Tutkiaksemme SwSCV-1:n toimintaa soluviljemissä ilman auttajavirusta kehitimme erilaisia plasmidipohjaisia infektiivisiä klooneja, jotka mahdollistivat soluviljelmien infektion transfektiolla. Pystyimme luomaan soluviljelmiin pysyvän SwSCV-1- infektion työkalujemme avulla. Infektoituneen boakäärmeen kudoksista ei löytynyt jälkiä HBV:n kaltaisesta viruksesta metatranskriptomiikkatutkimuksemme perusteella, mutta sen sijaan löysimme SwSCV 1:n infektoimista kudoksista reptarena- ja hartmaniviruksia. Löydösten perusteella epäilimme näiden virusten toimivan SwSCV-1:n auttajaviruksina, ja kehittämiemme soluviljelmämallien avulla kykenimme osoittamaan reptarena- ja hartmanivirussuperinfektion johtavan infektiivisten SwSCV-1- partikkelien tuotantoon. Tämän lisäksi osoitimme, että SwSCV-1- infektoituneiden solujen transfektio arena- ja hantavirusten glykoproteiinien tuottoa ohjaavilla plasmideilla johti infektiivisten SwSCV-1- partikkelien tuotantoon. Tutkiaksemme, ohjaako SwSCV-1:n genomista löytynyt toinen avoin lukuraami proteiinin tuotantoa, loimme infektiivisen kloonin, jossa proteiinin tuotto oli estetty pistemutaation avulla. Näiden tutkimusten aikana havaitsimme, että pysyvästi infektoituneet soluviljelmät tuottivat hiljattain SwSCV-1:llä infektoituneita soluja vähemmän infektiivisiä SwSCV-1- partikkeleita superinfektion seurauksena. Tutkiessamme ilmiön syytä tulimme osoittaneeksi, että SwSCV-1 tuottaa infektion aikana ainoastaan yhtä DAg muotoa, S-DAg:ia. Uusien HDV:n kaltaisten virusten löytyminen on osoittanut, että deltavirukset ovat huomattavasti monimutkaisempia ja laajakirjoisempia kuin HDV-tutkimusten perusteella on oletettu. Tarvitaan lisää tutkimusta, jotta voimme ymmärtää näiden aiemmin tuntemattomien virusten elinkaarta syvällisemmin. Tässä väitöskirjassa kuvatut työkalut luovat hyvän pohjan vastaavien työkalujen kehitykseen muille HDV:n kaltaisille viruksille. Tässä väitöskirjassa kuvaillut työkalut ovat helposti sovellettavissa muiden HDV:n kaltaisten virusten tutkimiseen ja tulevat auttamaan ymmärtämään tätä ainutlaatuista patogeeniryhmää.
Subject: virology
Rights: Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Leonóra_Szirovicza_dissertation_01082022.pdf 4.192Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record