Rapid Prototyping of Polymer-Based Organ-on-a-Chip Devices: The Impact of Materials on Cell Proliferation

Abstract

In vitro models of human tissue have advanced during recent years through the development of 3D cell culture models. However, they are not yet able to fully emulate the complexity of the complete cellular microenvironment in tissue. In vitro models can further benefit from microfluidic approaches that allow more intricate control of the cellular microenvironment through microfabrication and microfluidic flow. Microfluidic cell cultures that emulate some aspects of organ function are called organs-on-chips (OOC). Most of the OOC platforms utilize polydimethylsiloxane (PDMS) as a fabrication material, due to its optical clarity, inherent biocompatibility (nontoxicity), gas permeability and cost-effective fabrication. However, PDMS is not always the most desirable material for OOC applications, due to its hydrophobic surface (poor cell adhesion) and unspecific adsorption of small molecules (risk of false positives/negatives). More studies are required to develop alternative materials for OOC applications. The aim of this thesis work was to characterize two emerging classes of polymer-based microfabrication materials for their cell compatibility, namely a set of commercial acrylate resins commonly used in prototyping 3D microdevices by stereolithography and custom off-stoichiometric thiol-ene (OSTE) polymers used in rapid prototyping of planar microdevices by replicamolding techniques. In Publication I, four different commercial 3D printing materials were evaluated for their biocompatibility by studying cell survival on the material surface. Both growth curves and cell staining were used to assess cell proliferation on the surfaces with an emphasis on long-term survival of the cells. Autoclaving was found to be an important factor in making the 3D printing materials bioinert and suitable for cell culture. Furthermore, a microfluidic device using 3D design was developed to study cell adhesion strength on the material surface without any extracellular matrix (ECM) coating. Cell adhesion to the inert 3D printed surfaces under microfluidic flow was shown to be in the range of 3 dyne/cm2. In Publication II, long-term cell survival on differently microfabricated an off-stoichiometric thiol-ene (OSTE) surfaces was studied by evaluating cell proliferation and viability similar to those of the 3D printed materials. Different fabrication and postprocessing methods were used to evaluate and improve the biocompatibility of OSTEs. UV embossing was found to be the most straightforward microfabrication method for making OSTE material surfaces biocompatible and suitable for cell culture. A microfluidic device using a 2D planar design was developed to study the cell adhesion strength on the material surface without any ECM coating. OSTE material surface supported relatively fast adhesion already after 1.5 h incubation and had comparable adhesion strength to the 3D printing materials (after a 4-hour incubation). In Publication III, the previously reported oxygen scavenging property of thiol-rich OSTE was utilized to develop a two-compartment OSTE-PDMS hybrid device. The device incorporated a thin PDMS membrane between two OSTE compartments that were cured using different microfabrication methods to create a biocompatible cell culture compartment via UV embossing and an oxygen scavenging compartment via UV casting. The gas permeable PDMS membrane ensured unrestricted oxygen transfer between the two compartments. The developed device allowed creation of an on-chip oxygen gradient and precise spatiotemporal control of oxygen concentration in the cell culture chamber by only utilizing flow rate regulation. Furthermore, the device facilitated BALB-3T3 fibroblast and human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte (hiPSC-CM) cell cultures in an oxygen-controlled environment. Overall, this thesis demonstrated the need to study the biocompatibility of new microfabrication materials in long term in order to ensure their suitability for cell culture applications. When selecting fabrication materials for OOC applications, more emphasis should be put on their careful characterization prior to use. At best, clever combination of microfabrication materials and methods can enable cell culturing under conditions not achievable for static culture systems, such as the spatiotemporal oxygen control demonstrated in Publication III.

Ihmisen in vitro kudosmallit ovat kehittyneet 3D solumallien edistyksen avulla. Ne eivät kuitenkaan täysin emuloi kudosten monitahoista mikroympäristöä. In vitro mallit voivat hyötyä mikrofluidistisista menetelmistä, jotka mahdollistavat tarkan kontrollin solujen mikroympäristöstä mikrovalmistustekniikoita ja mikrofluidistista virtausta käyttämällä. Mikrofluidistisia solumalleja, jotka mallintavat joitakin aspekteja sisäelinkudosten toiminnasta, kutsutaan organ-on-chipeiksi (OOC). Suurimmaksi osaksi OOC-alustoissa käytetään polydimetyylisiloksaania (PDMS) valmistusmateriaalina, sen optisen läpinäkyvyyden, kaasujen läpäisevyyden ja kustannustehokkaan valmistusteknologia ansiosta. PDMS ei kuitenkaan ole aina paras materiaali OOC-applikaatioille, sen hydrofobisen pinnan ja epäspesifien pienmolekyylien adsorption takia. Lisää tutkimuksia tarvitaan, jotta vaihtoehtoisia materiaaleja voidaan kehittää OOC-applikaatioita varten. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli karakterisoida kahden polymeeripohjaisen valmistusmateriaalin soluyhteensopivuutta, sisältäen joukon kaupallisia akrylaattihartseja, joita käytetään mikrofluidisten laitteiden 3D-tulostukseen stereolitografialla, ja ei-stökiometrisia tioleeneja (eng. off-stoichiometric thiol-enes (OSTE)), joita käytetään planaaristen mikrolaitteiden replikointitekniikassa. Ensimmäisessä osajulkaisussa neljä kaupallista 3D-tulostusmateriaalia arvioitiin niiden bioyhteensopivuuden suhteen, tutkimalla solujen selviytymistä materiaalien pinnalla. Solujen proliferaatiota arvioitiin kasvukäyrällä ja soluvärjäyksillä, joissa painotus oli pitkäaikaisella solujen selviämisellä materiaalien pinnoilla. Autoklavointi todettiin parhaimmaksi menetelmäksi 3D-tulostusmateriaalien soluyhteensopivuuden varmistamiseksi. Lisäksi solujen adhesesiovoiman tutkimiseen suunniteltiin mikrofluidistinen laite, jossa soluja kasvatettiin 3D materiaalin pinnalla ilman proteiinimatriisipinnoitusta. Soluadheesio inerttiin 3D-tulostettuun pintaan mikrofluidististen virtauksen alla oli noin 3 dyne/cm2. Toisessa osajulkaisussa solujen pitkäaikaista selviytymistä tutkittiin arvioimalla solujen proliferaatiota ja elinkelposuutta eri tavoin valmistettujen OSTE-polymeerien pinnoilla. OSTE materiaalien bioyhteensopivuuden parantamiseksi testattiin erilaisia valmistus- ja jälkikäsittelymenetelmiä. UV-kohokuviointi todettiin suoraviivaisimmaksi valmistusmenetelmäksi soluyhteensopivien OSTE-materiaalien valmistamiseksi. Lisäksi soluadheesiovoimien tutkimiseen suunniteltiin planaari mikrofluidistinen laite, jossa soluja kasvatettiin ilman proteiinimatriisipinnoitusta OSTE-pinnoilla. OSTE-pinnat tukivat suhteellisen nopeaa solujen kiinnittymistä pintaan (inkubaatioaika 1 h 20 min) yhtä suurilla solujen adheesiovoimilla kuin 3D-tulostusmateriaalit 4 tunnin inkubaation jälkeen. Kolmannessa osajulkaisussa kehitettiin kaksikammioinen OSTE-PDMS-hybridilaite, jossa hyödynnettiin jo aiemmin julkaistua OSTE-materiaalien hapen kulutusominaisuutta. Laitteeseen liitettiin PDMS-kalvo kahden OSTE-kammion väliin, jotka valmistettiin eri valmistusmenetelmiä hyödyntäen. Toinen kammioista valmistettiin UV-kohokuvioinnilla bioyhteensopivaksi soluviljelyä varten ja toinen valmistettiin happea kuluttavaksi UV-valutekniikalla. Happea läpäisevä PDMS-kalvo varmisti hapen vapaan liikkuvuuden kahden kammion välillä. Kehitetty laite mahdollisti happigradientin luonnin ja hapen konsentraation ajasta riippuvan kontrolloinnin solukasvatuskammioissa pelkällä virtausnopeuden säätämisellä. Lisäksi laite tuki hiiren fibroblastien ja ihmisen indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettujen kardiomyosyyttien soluviljelyn happisäädellyssä ympäristössä. Kaiken kaikkiaan tämä väitöskirjatyö havainnollistaa tarpeen tutkia uusien mikrovalmistusmateriaalien pitkänaikavälin bioyhteensopivuutta, jotta materiaalien soveltuvuus soluviljelyyn voidaan varmistaa. Valittaessa valmistusmateriaalia OOC-sovelluksiin tulisi materiaalien karakterisointiin kiinnittää nykyistä enemmän huomiota. Parhaimmillaan valmistusmateriaalien ja –menetelmien taitavalla yhdistämisellä voidaan luoda solukasvatuksiin sellaiset olosuhteet, joita ei voida staattisin menetelmin saavuttaa. Tällainen on esimerkiksi happipitoisuden ajallispaikallinen kontrollointi, mikä osoitettiin kolmannessa osajulkaisussa.