Proteiinikinaasi C epsilon ja tyypin 2 diabetes : VHH-vasta-aineiden sitoutuminen proteiinikinaasi C epsilonin toiminnallisiin domaineihin

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151178
Title: Proteiinikinaasi C epsilon ja tyypin 2 diabetes : VHH-vasta-aineiden sitoutuminen proteiinikinaasi C epsilonin toiminnallisiin domaineihin
Author: Hovi, Marianne
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2012
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151178
http://hdl.handle.net/10138/34841
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmakologi
Pharmacology
Farmakologia
Abstract: The burden of diabetes is increasing globally as the number of people with diabetes reaches over 220 million. Over 90 per cent of these people are suffering from type 2 diabetes. This condition is primarily defined by the chronic increase in blood glucose level or hyperglycemia. Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and is usually associated with abnormal insulin secretion. Insulin resistance is a state where normal amount of blood insulin is inadequate to increase glucose uptake in the most important target tissues of insulin. Numerous reports demonstrate that oversupply of lipids leads to loss of insulin activity and the formation of type 2 diabetes. Protein kinase C (PKC) isozymes comprise a family of serine/threoninekinases, which have a regulatory role in a multiple cellular processes. PKC!-isozyme activity is known to play a role in insulin resistance and therefore in type 2 diabetes. Free fatty acid (FFA) induced insulin gene function inhibition is associated with phosphoinositide dependent kinase1 (PDK1) independent phosphorylation of PKC!-isozyme in the most important insulin target tissues. Phosphorylated PKC!-isozyme causes insulinreceptor gene expression inhibition. Present study is part of a VHH-antibodies related research where the goal is to characterize these antibodies and to find out their effects on protein kinase C. VHH-antibodies are Ilama derived antibodies which contain a single heavy-chain variable domain, that is fully capable of antigen binding. In this work, we studied VHH-antibodies binding to PKC!-isozyme and its functional domains. PKC!-isozyme and its domains were produced in Sf9-insect cells. The binding was studied using Western blot and immunoprecipitation assays. In addition, the binding of 368 VHHantibodies to PKCŒµ-isozyme's domain 2 were studied. With Western blot, it was discovered that E7-VHH-antibody binds to PKCŒµ-isozyme full length and to domain 3. Other VHHantibodies tested in Western blot did not bind to PKCŒµ-isozyme. Seven VHH-antibodies bound to PKCŒµ-isozyme in immunoprecipitation. All of these VHH-antibodies bound to the full length and to domain 3, but not to other domains. In radioligand binding assays none of the VHH-antibodies bound to domain 2 that is the binding site to the endogenous PKCŒµ-isozyme activator diacylglycerol (DAG). The results gathered with these three different methods were in line with each other. As the results gained from Western blot and immunoprecipitation show, all the VHH-antibodies, that bind to PKCŒµ-isozyme, bind to its domain 3. With this study, we succeeded to gather new information about the binding of VHH-antibodies to PKCŒµ-isozyme and its domains. The exact binding site has not been studied with so many VHH-antibodies before this study. Moreover, we also exploited methods that have not been used in this context before.Diabetes on merkittävä maailmanlaajuinen terveysongelma. On arvioitu, että maailmassa on tällä hetkellä yli 220 miljoonaa diabeetikkoa, joista yli 90 % sairastaa tyypin 2 diabetesta. Tämän sairauden peruspiirre on veren kroonisesti kohonnut glukoosipitoisuus eli hyperglykemia. Tyypin 2 diabetes johtuu pääasiassa insuliiniresistenssistä ja epänormaalista insuliinin erittymisestä. Insuliiniresistenssillä tarkoitetaan tilaa, jossa verenkierron normaali insuliinipitoisuus ei lisää glukoosin kuljetusta solujen sisään insuliinin tärkeimmissä kohdekudoksissa. Lukuisissa tutkimuksissa on osoitettu vapaiden rasvahappojen vaikuttavan insuliinin tehon heikkenemiseen ja siten tyypin 2 diabeteksen muodostumiseen. Proteiinikinaasi C (PKC) isoentsyymit kuuluvat seriini/treoniinikinaasien suurperheeseen, jolla on keskeinen rooli useissa solutason tapahtumissa. PKCŒµ-isoentsyymin aktiivisuuden on todettu vaikuttavan myös insuliiniresistenssiin ja sitä kautta tyypin 2 diabetekseen. Vapaiden rasvahappojen aikaansaaman insuliinireseptorin geenitoiminnan estymisen on yhteydessä PKCŒµ-isoentsyymin fosforylaatioon insuliinin tärkeimmissä kohdesoluissa. Fosforyloitunut PKCŒµ-isoentsyymi saa aikaan insuliiniresepterorin geeniekspression estymisen. Tämä erikoistyö on osa VHH-vasta-aineisiin liittyvää tutkimusta, jonka tarkoituksena on karakterisoida VHH-vasta-aineita ja selvittää niiden vaikutuksia PKC:hen. VHH-vasta-aineet ovat laamoista eristettyjen vasta-aineiden raskaan ketjun vaihtelevia osia ja ne pystyvät sitomaan antigeenin vain yhden vaihtelevan osansa avulla. Erikoistyössä tutkittiin mihin PKCŒµ-isoentsyymin toiminnallisiin domeeneihin VHH-vasta-aineet sitoutuvat. Lisäksi tutkittiin VHH-vasta-aineiden sitoutumista koko PKCŒµ-isoentsyymiin. PKCŒµ-isoentsyymin koko proteiinia ja muita domeeneja tuotettiin Sf9-hyönteissoluissa. Sitoutumista tutkittiin Western blottauksen ja immunopresipitaation avulla. Radioligandisitoutumiskokeissa tutkittiin yhteensä 368 VHH:n sitoutumista domeeni 2-osaan. Western blot-menetelmällä havaittiin E7-VHH-vasta-aineen sitoutuminen PKCŒµ-isoentsyymin koko proteiiniin ja domeeni 3-osaan. Muut Western blot-kokeissa tutkitut VHH-vasta-aineet eivät sitoutuneet PKCŒµ-isoentsyymiin. Kaikki VHH:t, jotka sitoutuivat immunopresipitaatiokokeissa koko proteiiniin, sitoutuivat myös domeeni 3-osaan, mutta eivät muihin domeeneihin. Radioligandi-sitoutumiskokeissa kokeissa saatujen tulosten perusteella mikään VHH-vastaaine ei sitoudu domeeni 2-osaan, joten VHH-vasta-aineet eivät näyttäisi sitoutuvan samaan kohtaan kuin endogeeninen PKCŒµ-aktivaattori diasyyliglyseroli (DAG). Käytettyjen kolmen eri tutkimusmenetelmän avulla saadut tulokset olivat keskenään yhdenmukaisia. Western blot-menetelmällä ja immunopresipitaatiokokeissa saatujen tulosten perusteella voitiin todeta, että kaikki PKCŒµ-isoentsyymiin sitoutuvat VHH-vastaaineet sitoutuvat kinaasiosaan. Erikoistyön avulla onnistuttiin saamaan uutta tietoa VHHvasta- aineiden sitoutumisesta PKCŒµ-isoentsyymiin. VHH-vasta-aineiden tarkempaa sitoutumiskohtaa PKCŒµ-isoentsyymiproteiinissa ei ole aikaisemmin tutkittu näin monella VHH-vasta-aineella. Tässä tutkimuksessa VHH-vasta-aineiden sitoutumista PKCŒµ-isoentsyymiin tutkittiin lisäksi menetelmillä, joita ei ole kokeiltu aiemmin tässä yhteydessä.
Subject: VHH
type 2 diabetes
insulin resistance
protein kinase C epsilon
insuliiniresistenssi
proteiinikinaasi C epsilon
tyypin 2 diabetes


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
tiivistelma_t ja gradu Hovi.pdf 2.157Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record