Neurosteroidien analyysi virtsanäytteistä kaasukromatografia-ilmanpaine fotoionisaatio-tandem massaspektrometria -tekniikalla

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151182
Title: Neurosteroidien analyysi virtsanäytteistä kaasukromatografia-ilmanpaine fotoionisaatio-tandem massaspektrometria -tekniikalla
Author: Takala, Anna
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2012
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151182
http://hdl.handle.net/10138/34875
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmaceutisk kemi
Pharmaceutical Chemistry
Farmaseuttinen kemia
Abstract: Neurosteroids are steroids which are active in the central nervous system. They have many biological and physiological functions in human body. Fluctuations of the neurosteroid concentrations are related to many diseases such as depression, schizophrenia and epilepsy. Neurosteroid levels are measured to understand their role in brain function and human behavior. The aim of the work was to develop a gas chromatographic-atmospheric pressure fotoionization-tandem mass spectrometric (GC-APPI-MS/MS) method for analyzing 19 neurosteroids and their metabolites in urine. Neurosteroids are excreted in urine mainly as conjugates, so they have to be hydrolyzed before analysis. Sample purification is done by liquid-liquid extraction and the analytes are subsequently derivatized to enhance their volatility. Because widely used β-glucuronidase/arylsulfatase-enzyme from Helix pomatia oxidases 3β-hydroxy-5-ene and 3β-hydroxy-5α-reduced steroids, we decided to use β-glucuronidase from Escherichia coli and acid hydrolysis instead of H. pomatia. The quantification of the total neurosteroid concentration in urine was challenging because β-glucuronidase enzyme from E. coli did not hydrolyze glucuronides completely and acid hydrolysis deconjugated also glucuronides in addition to sulfate conjugates. In addition the internal standard d4-allopregnanolone was noticed to be impure and degrade during acid hydrolysis. The limits of detection were reasonably low for the method (2 pg/ml-1 ng/ml). The retention times of the analyte peaks were very repeatable (RSD 0,06-0,11%) and the repeatability of the method was acceptable for all compounds (RSD < 27%). Urine samples from two males and two females were analyzed with the preliminary validated method. We could determine estimated concentrations for dehydroepiandrosterone, dihydrotestosterone, androstenedione, testosterone, estrone, β-estradiol, estriol, 5α-tetrahydrodeoxocorticosterone, cortisone, corticosterone and hydrocortisone. The developed method did not meet all the aims of this work. The method needs further validation and more exact investigation about the effect of the selected hydrolysis method on intact steroids. Also the internal standard should be changed to some other compound, preferably a non-deuterated one.Neurosteroidit ovat aivoissa ja keskushermostossa vaikuttavia steroideja, joilla on monia biologisia ja fysiologisia vaikutuksia elimistössä. Neurosteroidien pitoisuuksien muutoksilla arvellaan olevan vaikutuksia monissa taudeissa, esimerkiksi masennuksessa, skitsofreniassa ja epilepsiassa. Neurosteroidien pitoisuuksia mitataan, jotta pystytään paremmin ymmärtämään steroidien roolia aivojen toiminnassa ja ihmisen käyttäytymisessä. Työn tarkoituksena on kehittää edelleen menetelmää neurosteroidien analysoimiseksi virtsanäytteistä kaasukromatografia-ilmanpaine fotoionisaatio-tandem massaspektrometria -tekniikalla (GC-APPI-MS/MS). Tutkimuksessa on mukana 19 eri neurosteroidia tai niiden aineenvaihduntatuotetta. Neurosteroidit erittyvät virtsaan pääasiassa konjugaatteinaan, joten näytteet hydrolysoidaan ennen analyysiä. Hydrolysoinnin jälkeen näyte käsitellään neste-nesteuutolla ja derivatisoidaan haihtuvuuden parantamiseksi. Koska yleisesti käytetty Helix pomatiasta peräisin oleva β-glukuronidaasi/aryylisulfataasi-entsyymi hapettaa 3β-hydroksi-5-eeni ja 3β-hydroksi-5α-pelkistyneitä steroideja, valittiin vaihtoehtoisiksi hydrolyysimenetelmiksi Escherichia colin β-glukuronidaasientsyymi sekä sulfaattikonjugaattien hajottamiseen happohydrolyysi. Neurosteroidien kokonaismäärän määrityksen havaittiin olevan haasteellista valituilla menetelmillä, koska E. colin entsyymit eivät hydrolysoineet glukuronideja täydellisesti ja happohydrolyysi hajotti sulfaatti-konjugaattien lisäksi myös glukuronidikonjugaatteja. Lisäksi sisäisenä standardina käytetyn d4-allopregnanolonin havaittiin olevan epäpuhdasta ja hajoavan ainakin happohydro-lyysikäsittelyssä. Käytetyllä menetelmällä havaintoalarajat olivat suhteellisen alhaisia (2 pg/ml-1 ng/ml). Menetelmän toistettavuus oli melko hyvä kaikille yhdisteille (RSD alle 27 %) ja menetelmä oli hyvin toistettava retentioajan (RSD 0,06-0,11 %) suhteen. Alustavasti validoidulla menetelmällä analysoitiin kahden miehen ja kahden naisen virtsanäytteitä. Virtsasta pystyt-tiin määrittämään arvioidut pitoisuudet dehydroepiandrosteronille, dihydrotestosteronille, androsteenidionille, testosteronille, estronille, β-estradiolille, estriolille, 5α-tetrahydrodeok-sikortikosteronille, kortisonille, kortikosteronille sekä hydrokortisonille. Kehitetty mene-telmä ei täyttänyt kaikkia sille asetettuja tavoitteita. Menetelmä täytyy validoida perusteelli-semmin sekä tutkia tarkemmin hydrolyysien vaikutus kantayhdisteisiin. Myös sisäinen standardi on vaihdettava toiseen, mieluiten ei-deuteroituun yhdisteeseen.
Subject: neurosteroids
urine
gas chromatography
mass spectrometry
atmospheric pressure fotoionization
neurosteroidit
kaasukromatografia
massaspektrometria
ilmanpaine fotoionisaatio
virtsa


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record