Yliopiston etusivulle Suomeksi På svenska In English Helsingin yliopisto

Retrotransposon BARE1 translation, localization, and VLP formation in barley

Show full item record

Files in this item

Files Description Size Format View/Open
retrotra.pdf 1.594Mb PDF View/Open
Use this URL to link or cite this item: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-8375-4
Vie RefWorksiin
Title: Retrotransposon BARE1 translation, localization, and VLP formation in barley
Author: Jääskeläinen, Marko
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Biological and Environmental Sciences, Department of Biosciences, GeneticsInstitute of Biotechnology
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Retrotransposons are major components of most eukaryotic genomes. They resemble retroviruses except that their lifecycle is limited to within the boundaries of the cell. In this thesis work, the goal was to understand the replication of the BARE1 retrotransposon which belongs to the Class I LTR (Long Terminal Repeat) transposable elements (TEs) of the Copia superfamily. The BARE family constitutes about 2.9% of the barley (Hordeum vulgare L.) genome. We systemically searched Expressed Sequence Tag (EST) databases for transcriptionally active TEs, and found that BARE and LTR -retrotransposons in general are shared and widely active in grasses. We raised antibodies to the BARE1 capsid (GAG), integrase (INT), and reverse-transcriptase-RNaseH (RT-RH) proteins and showed that the BARE1 is expressed as one polyprotein of 150 kDa, processed into a shorter 90 kDa form after cleavage of the RT-RH, and further into mature-sized GAG and INT. These proteins were present in barley almost constitutively; only drought-stress had a positive effect on the levels of the GAG protein. Our results show, for the first time, that pools of retrotransposon polyproteins in plant cells are conserved and abundant enough to be detected immunologically in wide selection of species in the Gramineae. We studied the potential sites for BARE replication in barley by immune and in situ localizations. Both root and shoot apical meristems showed the presence of the BARE proteins, supporting the strategy that newly inserted copies must be carried clonally to the cells giving rise to gametes in order to survive in succeeding generations. Moreover, the cells in phloem companion cells showed localization that suggests the BARE may be able to move within the vasculature of the barley. Density gradients were used to study whether the BARE forms VLPs in barley cells. Fractions positive for BARE1 GAG and INT were visualized in transmission electron microscopy using negative staining. This was the first time VLPs were demonstrated in any plant. The VLP assembly requires excess amounts of GAG, whereas the BARE1 encodes its proteins in a single open reading frame. We observed three different pools of RNA transcripts, one for the polyprotein translation, one for encapsidation and reverse transcription, and a third one that is spliced so that it can translate only GAG, thus contributing to a comparatively larger pool of GAG. The transcript dedicated for encapsidation lacks both the cap and poly(A) for translatability, but contains the R regions critical for replication into the complementary DNA that can be inserted back into the host genome. Evidence for these new BARE insertions was found by comparing polymorphism revealed by PCR methods between several grass species. Taken together, we found that the BARE elements are capable to accomplish their lifecycle not only in barley, but in grass species in general, and thus contribute to the growth of their genome sizes.Kasvien perimästä suuri osa koostuu toistuvista DNA jaksoista. Retrotransposonit muodostavat tästä toistuvasta DNA:sta pääosan, kattaen eräillä kasveilla jopa 70% perimästä. Retrotransposonit muistuttavat retroviruksia rakenteeltaan ja elinkierroltaan. Ne muodostavat viruksenkaltaisia partikkeleita (virus-like particle, VLP), joista kuitenkin puuttuu solusta ulospääsyyn tarvittava valkuaisaine. VLP:n tehtävänä on kuljettaa retrotransposonien DNA takaisin tumaan, jossa se liitetään takaisin perimään. Uusi kopio on aina perimän mutaatio jonka laatu riippuu paikasta perimässä. Lisäksi perimän koko kasvaa kopioluvun kasvaessa. Tässä väitöskirjatyössä on tutkittu ohran BARE1 retrotransposonin ilmenemistä kasveilla, kuten ohralla. BARE1 on ensimmäinen ohrasta löydetty retrotransposoni. Se kuuluu BARE retrotransposoni perheeseen joka muodostaa noin 2,9% ohran perimästä. Seuloimme yksi- ja kaksisirkkaisten kasvien ilmentyvien geenien osasekvenssejä (Expressed Seguence Tag) aktiivisten retrotransposonien löytämiseksi. Havaitsimme että poiketen kaksisirkkaisista yksisirkkaisilla heinäkasveilla, kuten viljoilla, on yhteisiä aktiivisia retrotransposoneita, kuten BARE1. Valmistimme vasta-aineita BARE1:n valkuaisaineita vastaan ja havaitsimme, että BARE on aktiivinen tuottaen valkuaisaineita kaikissa tutkimissamme vilja- ja heinäkasveissa. Lisäksi BARE aktiivisuuden havaittiin muuttuvan ohrassa kuivastressin aikana, koska VLP:tä muodostavan valkuaisaineen määrät kasvoivat. Tätä tukee myös toisissa tutkimuksissa havaittu BARE kopioluvun kasvu villiohran perimässä mitä kuivemmalla paikalla kasvi on kasvanut. Tutkimme kykeneekö BARE muodostamaan VLP:tä uuttamalla ohran soluja ja erottamalla uutteesta VLP:t tiheysgradientilla. Fraktioiden, jotka sisälsivät BARE1 komponentteja, havaittiin elektronimikroskopian avulla sisältävän myös VLP:tä. Kasveilta ei tätä ennen ole löydetty VLP:tä. Selvitimme VLP:tä muodostavan valkuaisaineen lähetti-RNA molekyylejä ja havaitsimme että BARE1 tuottaa uudenlaisella tavalla kolmea eri RNA populaatiota, yhtä oman perimänsä säilyttämiseen ja kahta muuta valkuaisaineiden tuottoon. Koska kasvit eivät muodosta erillistä sukusolulinjaa, olisi uusien BARE kopioiden selviydyttävä kloonautumalla sukusoluihin. Tutkimme tätä paikantamalla BARE valkuaisaineita immunologisesti ohran solukoissa ja havaitsimme niiden määrät runsaimmiksi kasvupisteissä, mikä tukee teoriaa. Lisäksi valkuaisaineita löytyi myös siiviläputkien seurasoluista viitaten BARE1:n mahdolliseen liikkumiseen johtosolukossa, mikä olisi ennenkuulumatonta. Merkkejä uusista BARE1 kopioista havaitsimme geenimerkkien välisestä polymorfiasta. Tämä opinnäytetyö antaa uusia näkökulmia ja vahvistaa käsitystä retrotransposonien merkityksestä kasvien perimään ja sen kokoon.
URI: URN:ISBN:978-952-10-8375-4
http://hdl.handle.net/10138/37278
Date: 2012-11-16
Copyright information: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
This item appears in the following Collection(s)

Show full item record

Search Helda


Advanced Search

Browse

My Account