Yliopiston etusivulle Suomeksi På svenska In English Helsingin yliopisto

UGTs and glucuronidation analyses in Caco-2 cells, human microsomes and recombinant enzymes

Show full item record

Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

Use this URL to link or cite this item: http://urn.fi/URN:ISBN:978-952-10-8265-8
Vie RefWorksiin
Title: UGTs and glucuronidation analyses in Caco-2 cells, human microsomes and recombinant enzymes
Author: Zhang, Hongbo
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Thesis level: Doctoral dissertation (article-based)
Abstract: Glucuronidation of drugs and several endogenous compounds is catalyzed by the UDPglucuronosyltransferase(UGT) enzymes, membrane proteins of the endoplasmic reticulum that are variably expressed in the liver, intestine and few other tissues.

In this PhD research it was first studied UGTs expression and glucuronidation activity in Caco-2 cells, a common model system for drug absorption in the intestine. Caco-2 cells differentiation significantly stimulated UGTs expression and glucuronidation activity. However, the activity of most UGTs, with the exception of UGT1A6, was very low in comparison to the human intestinal or liver microsomes (HIM and HLM, respectively), indicating that these cells do not provide a good model system for drug glucuronidation in the intestine.

The second part of this thesis studied the different aspects of improving the use of recombinant UGTs and the in vitro glucuronidation assays. It included the possible use of DMSO, up to 10% (volume per volume), in studying the glucuronidation of highly lipophilic substrates, and the effect of alamethicin addition that is now recommended mainly for the assays using HLM or HIM and in combination of only low DMSO concentrations. In addition, it was found out that glucuronidation experiments with compounds containing free carboxylic acid groups should be done at both pH 6.0 and pH 7.4. The lower pH value is recommended for reducing acyl migration and stimulating the activity of many UGTs, whereas the higher pH would be needed to test whether or not UGT2B15, the only UGT that is inactive at pH 6.0, catalyzes the test compound.

A method to quantitatively evaluate the contributions of individual UGTs to the combined activity of a tissue sample, the relative activity factor (RAF), approach was also examined. This study, done in collaboration with a Chinese laboratory from the Dalian Institute of Chemical Physics, turned out to be very good, if selective substrates or inhibitors for the different UGTs that catalyze the test reaction are available.

Finally, I also tried to improve the quality of recombinant UGTs that were produced in baculovirus-infected Spodoptera fragiperda 9 (Sf9) insect cells, mainly by further improving the infection optimization tests that were developed in order to reduce the fraction of inactive recombinant UGT in the produced samples. Another part of that study was to examine the possible effects of the C-terminal fusion peptide that ends with 6 His residues (His-tag) on the enzyme kinetics of the recombinant UGTs. The detailed studies revealed that there were no significant adverse effects of this fusion peptide, therefore prompting us to continue using it due to the possibilities it opens for relatively easy testing of the expression level of the different recombinant UGTs.

Taken together, this thesis contains several topics, all of which are related to the use of UGT enzymes in glucuronidation studies, and largely productive efforts to improve them.

In addition to the specific findings with several different UGTs, the results are expected to be useful for future in vitro studies in the field.Uusien lääkkeiden tulee olla turvallisia ja tehokkaita. Lääkeaineiden arviointi keskittyy niiden farmakokineettisiin ADME-ominaisuuksiin eli imeytymiseen, jakautumiseen, metaboliaan ja eritykseen, joista metabolialla on suurin merkitys.

Metaboliatapahtumien tutkinta on tärkeä lääkeainekehityksen vaihe, ja UDP-glukuronosyylitransferaasientsyymien (UGT) toiminta on siinä keskeisessä osassa. UGT:t kykenevät konjugoimaan useita eri substraatteja liittämällä näihin glukuronihapon. Tämä useimmiten inaktivoi substraatin, mutta myös lisää sen hydrofiilisyyttä ja eritystä elimistöstä.

Ensimmäisessä osassa väitöskirjatyötä arvioimme UGT-entsyymien ilmentymistä paksusuolen syöpäsolulinjassa Caco-2, ja näiden solujen toimivuutta mallina ihmisen suolistossa tapahtuvalle lääkeaineglukuronidaatiolle. Työssä selvisi, että vaikkakin solujen erilaistuminen lisää UGT-entsyymien ilmenemistä Caco-2 -soluissa, niissä tapahtuva lääkeaineiden glukuronidaatio aliarvioi silti merkittävästi ihmisen suolistossa tapahtuvaa UGT-entsyymien ilmenemistä ja aktiivisuutta. Ainoa poikkeus tähän oli UGT1A6.

Seuraavana tavoitteenamme oli parantaa rekombinanteilla UGT-entsyymeillä sekä ihmisen maksan ja ohutsuolen mikrosomeilla tehtäviä in vitro glukuronidaatiokokeita. Havaitsimme, että DMSO:n lisäys 10%:iin (v/v) saakka voi parantaa glukuronidaatiota hyvin lipofiilisillä yhdisteillä kuten steroideilla. Alametisiinia, reikiä tekevää peptidiä tarvitaan ihmismikrosomeilla, mutta ei rekombinantti UGT:lla tehdyissä glukuronidaatiokokeissa, ja asyyliglukuronidien muodostumista tulisi tutkia sekä pH:ssa 7.4 että pH:ssa 6.0.

Osallistuimme glukuronidaatiomenetelmätutkimukseen suhteellisesta aktiivisuustekijästä (RAF). Tämä tutkimus osoitti, että on hyödyllistä selvittää yksittäisten UGT-entsyymien osuudet ihmisen maksan tai ohutsuolen mikrosominäytteiden kokonaisaktiivisuuksista.

Lopuksi, paransimme bakulovirus infektoiduissa Spodopterafragiperda 9 (Sf9) hyönteissoluissa tuotettujen UGT:den laatua säätelemällä infektoivan viruksen määrää. Lisäksi osoitimme, että ryhmämme valmistama C-terminaalinen fuusiopeptidi jossa on His-tag, ei vaikuttanut juuri lainkaan UGT:den entsyymikineettisiin ominaisuuksiin, ja sitä voidaan käyttää antigeenikohtana UGT-entsyymien kvantitatiivisessa määrityksessä.

Kaiken kaikkiaan, tämän väitöskirjan tulokset edistävät merkittävästi in vitro lääkeaineglukuronidaatiotutkimuksia tulevaisuudessa.
URI: URN:ISBN:978-952-10-8265-8
http://hdl.handle.net/10138/37359
Date: 2012-11-09
Copyright information: This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
This item appears in the following Collection(s)

Show full item record

Search Helda


Advanced Search

Browse

My Account