Ekstrasynaptiset GABAA-reseptorit lääkekehityksen kohteena : [3H]muskimolin assosiaatio ja dissosiaatio

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151207
Title: Ekstrasynaptiset GABAA-reseptorit lääkekehityksen kohteena : [3H]muskimolin assosiaatio ja dissosiaatio
Author: Taina, Kaisa
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Pharmacy
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2013
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201801151207
http://hdl.handle.net/10138/38265
Thesis level: master's thesis
Discipline: Farmakologi
Pharmacology
Farmakologia
Abstract: γ-aminobutyric acid (GABA) is the major inhibitory neurotransmitter in the brain and it's activity is mediated via metabotropic GABAB - and ionotropic GABAA receptors. Receptors containing αβγ subunit combination are localized in both synaptic and extrasynaptic sites and they mediate fast synaptic phasic activity. αβδ- and α5βγ-containing receptors reside only in extrasynaptic space where they regulate tonic inhibition of the nerve cell. Disruption in tonic inhibition may cause several diseases. Drugs that selectively affect extrasynaptic GABAA receptors are believed to help treatment of diseases like sleep disorder, neuropsychiatry disorders, epilepsy, cognition impairment and recovery from stroke. Drug development of δ- selective GABAA agonists and positive modulators that enhance tonic inhibition as well as α5βγ selective inverse agonists that reduce tonic inhibition and enhance cognition are under investigation right now. Muscimol is a psychoactive molecule which activates all GABAA receptors but has higher affinity to cerebellar granule cell-specific receptor subtypes α6β2γ2 and extra synaptic α6β2δ than to the most common receptor subtype α1β2γ2. However, the binding of [3H]muscimol has produced contradictory results in former studies. Binding to membrane homogenates results to binding levels of the same magnitude in most brain regions, while in receptor autoradiography the high affinity binding is δ-subunit dependent. The affinity of muscimol to GABAAR subtypes has thus far been determined using saturation analysis, i.e. by measuring concentration-dependent binding of [3H]muscimol at equilibrium and by determining KD, the dissociation constant of the ligand. However, this value expresses the affinity of the ligand to the receptor, but does not give any information on the rate of the association and dissociation. In this master's thesis I have investigated association and dissociation rate of [3H]muscimol from recombinant GABAA receptors and from native GABAA receptors present in wild-type (WT) and δ-subunit knock-out (δKO) mice forebrain and cerebellar membranes. We concluded from binding assays that [3H]muscimol dissociates extremely slowly from δ-receptors. This explains further contradictory results: in membrane/filtration assay the washing procedure is generally much faster resulting in only low dissociation from αβγ receptors, while in the long washing procedure of receptor autoradiography only αβδ-binding is retained. The high affinity of muscimol to αβδ receptors is suggested to be due to its extremely slow dissociation from these receptors. Also association of [3H]muscimol to αβδ receptors seems to be slower, but this needs confirming studies. The exceptional binding properties of muscimol make it an interesting leading molecule in development of drugs which act via extrasynaptic GABAA receptors.γ-aminovoihappo (GABA) on aivojen pääasiallinen estävä välittäjäaine, jonka vaikutuksia välittävät ionotrooppiset GABAA- ja metabotrooppiset GABAB-reseptorit. αβγ-alayksiköistä koostuvat GABAA-reseptorit sijoittuvat sekä synaptisiin että ekstrasynaptisiin alueisiin hermosoluissa ja ne säätelevät nopeaa faasista aktiivisuutta. αβδ- ja α5βγ-reseptorit sijoittuvat pelkästään hermosolujen ekstrasynaptisille alueille ja ne säätelevät aivojen hermovälityksen perustonusta. Aivojen toonisen inhibition häiriintyminen saattaa olla useiden sairauksien taustalla. Selektiivisesti ekstrasynaptisten GABAA-reseptorien kautta vaikuttavien lääkeaineiden toivotaan tuovan helpotusta esimerkiksi unihäiriöiden, hormonaalisen epätasapainon aiheuttamien neuropsykiatristen häiriöiden, epilepsian, kognitiivisen suorituskyvyn heikkenemisen ja aivovaurioiden hoitoon. Lääkeainekehityksen kohteena ovat tällä hetkellä δ-selektiiviset GABAA-agonistit ja positiiviset modulaattorit, jotka parantavat aivojen toonista inhibitiota, sekä myös α5-selektiiviset käänteisagonistit, jotka vähentävät toonista inhibitiota mutta parantavat kognitiivista suorituskykyä, oppimista ja muistia. Muskimoli on psykoaktiivinen aine, joka aktivoi kaikkia GABAA-reseptorialatyyppejä, mutta sen affiniteetti on korkeampi pikkuaivojen jyvässolujen α6β2γ2-reseptoreihin ja erityisesti jyvässolujen soomaosiin lokalisoituviin α6β2δ-reseptoreihin kuin aivojen pääasialliseen GABAA-reseptorialatyyppiin α1β2γ2. Kuitenkin [3H]muskimolilla suoritetut sitoutumiskokeet ovat antaneet ristiriitaisia tuloksia. Aivosoluhomogenaateilla suoritetuissa kokeissa sitoutuminen on ollut samansuuruista lähes kaikilla aivoalueilla, kun taas autoradiografiakokeissa sitoutuminen näyttäisi olevan voimakkainta δ-reseptoreita sisältävillä aivoalueilla. [3H]muskimolin affiniteettia eri reseptorialatyyppeihin on tähän asti määritetty tasapainotilassa määrittämällä tasapainovakio KD, joka ei kerro erikseen ligandin assosiaation ja dissosiaation nopeudesta, vaan sitoutumisen hanakkuudesta. Erikoistyössäni tutkittiin [3H]muskimolin assosiaatiota ja dissosiaatiota eri GABAArekombinanttireseptorialatyypeissä sekä δ-poistogeenisten ja villityypin hiirien etu- ja pikkuaivosolukalvohomogenaateissa. Sitoutumiskokeet osoittivat, että [3H]muskimoli dissosioituu erittäin hitaasti δ-alayksikön omaavista reseptoreista. Tämä selittää aikaisempia ristiriitaisia tuloksia. Suodatusmenetelmässä pesuvaihe on huomattavasti lyhyempi, joten [3H]muskimoli ei ehdi dissosioitumaan merkittävästi αβγ-reseptoreista, toisin kuin autoradiografian pitkässä pesuprosessissa, jolloin jäljelle jää αβδ sitoutuminen. Muskimolin korkea affiniteetti αβδ-reseptoreihin johtuu luultavasti sen hitaasta dissosiaatiosta näistä reseptoreista. Lisäksi muskimolin assosiaatio vaikuttaisi olevan hitaampaa αβδ-reseptoreihin, mutta tämä vaatii vielä lisätutkimuksia. Muskimolin poikkeukselliset sitoutumisominaisuudet tekevät siitä mielenkiintoisen johtomolekyylin ekstrasynaptisesti vaikuttavien lääkeaineiden kehittämiseen.
Subject: GABAA-reseptori
muskimoli
sitoutuminen
assosiaatio
dissosiaatio
affiniteetti


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Gradu Taina Kaisa.pdf 2.072Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record