Anabaena 90 -syanobakteerin villityypin ja apd--mutantin proteomien ja anabaenopeptilidigeenien ilmentymisen vertailu

Abstract

Syanobakteerit ovat vesistöissä ja maaperässä eläviä yhteyttäviä organismeja. Ne jaetaan morfologiansa perusteella Chroococcales-, Pleurocapsales-, Oscillatoriales-, Nostocales- ja Stigonematales-lahkoihin. Anabaena 90 -syanobakteerikanta on Nostocales-lahkoon kuuluva, rihmamainen syanobakteeri. Se eristettiin Vesijärvestä vuonna 1986. Kanta tuottaa erilaisia bioaktiivisia yhdisteitä, joista tutkituimpia ovat mikrokystiinit, anabaenopeptiinit ja anabaenopeptilidit. Bioaktiivisia yhdisteitä tuotetaan ei-ribosomaalisten peptidisyntetaasien (NRPS) avulla, mutta yhdisteiden merkitys syanobakteereille on epäselvä. Anabaena 90 –villityyppikannasta (WT) on valmistettu anabaenopeptilidimutantti (apd-), joka ei muodosta anabaenopeptilidejä.

Työn tavoitteena oli selvittää WT- ja apd--kannan proteomien välisiä eroja kuusipäiväisen kasvatuskokeen aikana. Samanaikaisesti tutkittiin kantojen anabaenopeptilidi (apd) –syntetaasigeenien ilmentymistä. Tavoitteena oli kartoittaa mahdollisia kantojenvälisiä eroja yksittäisten proteiinien tuotossa ja apd-syntetaasigeenien ilmentymisessä. Tämän toivottiin lisäävän Anabaena 90 -syanobakteerin aineenvaihdunnan tuntemusta.

Proteomeja tutkittiin kaksisuuntaisen erottelevan geelielektroforeesin (2D-DIGE) avulla. Proteomien välisten erojen tilastolliseen tarkasteluun käytettiin t-testiä. Anabaenopeptilidigeenien ilmentymistä tutkittiin käänteiskopioijapolymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR).

Tulosten perusteella voitiin todeta, että WT- ja apd--kannan proteomit poikkesivat toisistaan. 18 proteiinin määrässä havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero kantojen välillä. Yksittäisten proteiinien määrät olivat useammin koholla apd--kannassa. Molempien kantojen apd-syntetaasigeenit ilmentyivät, joten mutaatio apd--kannassa ei estänyt apd-transkriptien muodostumista. Jatkoa ajatellen tilastollisesti merkitsevien proteiinien tunnistaminen olisi oleellista. Se paljastaisi syitä WT- ja apd--kannan proteomien eroavaisuuksiin ja antaisi lisätietoa Anabaena 90 –syanobakteerin aineenvaihdunnasta.

Cyanobacteria are aquatic and terrestrial organisms that have photosynthetic cababilities. Cyanobacteria are classified to five orders according to their morphology. These are Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales and Stigonematales. Anabaena sp. 90 is a filamentous cyanobacterium in the order of Nostocales. A sample of this cyanobacterium was isolated from the lake Vesijärvi in 1986. Anabaena sp. 90 produces a variety of bioactive peptides such as microcystins, anabaenopeptins and anabaenopeptilides which are the most commonly studied of the peptides produced by the strain. Majority of the bioactive peptides are produced by non-ribosomal peptide synthetases (NRPS). The way these compounds affect cyanobacteria is currently unclear. Anabaenopeptilide deficient mutant (apd-) variety has been developed from the Anabaena sp 90 wild type (WT). The mutant is unable to produce anabaenopeptilides.

The aim of my Master´s thesis was to study the changes in proteomes of WT and apd- strains by conducting a six day cultivation experiment. The purpose was to evaluate the possible differences in the amount of proteins that the different cultivation stocks were able to produce. The secondary purpose was to examine the transcription of anabaenopeptilide synthetase genes.

Proteomic study was performed using a procedure called two dimensional differential gel electrophoresis (2D DIGE). The differences in the proteomes´ statistics were examined by using the Student´s t test. Transcription of anabaenopeptilide synthetase genes were studied using a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).

The data collected from these studies concluded that there were differences in the proteomes of WT and apd- strains. In eighteen cases there were significant differences in the protein amounts between the strains. The single protein counts were often higher in the apd- than in the WT strain. Anabaenopeptilide synthetase genes were transcribed in both strains which suggests that the mutation in the apd- strain did not hinder the ability of the strain to produce anabaenopeptilide transcripts. The identification of significant proteins would yield more detailed knowledge of the metabolical functions of WT and apd- strains.