Ravintotekijöiden vaikutus β-kateniinin aminohappotähteiden fosforylaatioon paksusuolisyöpämalleissa

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212210
Title: Ravintotekijöiden vaikutus β-kateniinin aminohappotähteiden fosforylaatioon paksusuolisyöpämalleissa
Author: Diaz, Heli
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestry, Department of Food and Environmental Sciences
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2014
Language: fin
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507212210
http://hdl.handle.net/10138/45423
Thesis level: master's thesis
Discipline: Näringslära
Nutrition
Ravitsemustiede
Abstract: Johdanto: ?-kateniini on proteiini, joka toimii osana solun kasvua edistävää Wnt-reittiä. ?-kateniinin säätelyjärjestelmän häiriintyminen edistää esisyöpägeenien eli proto-onkogeenien ilmentymistä, mikä johtaa solujen hallitsemattomaan jakautumiseen ja suolistosyövän kehittymiseen. ?-kateniinia säädellään solussa sen hajottamisen ja fosforylaation avulla. ?-kateniinin fosforyloitumisen seriini552- ja seriini675-aminohappotähteistä on osoitettu lisäävän proto-onkogeenien ilmentymistä, ja sitä kautta edistävän suolistosyövän kehittymistä. Toistaiseksi on vain yksittäisiä julkaisuja siitä, miten ravinto vaikuttaa ?-kateniinin fosforyloitumiseen suoliston limakalvolla. Tavoitteet: Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää fluoresenssiin perustuvaa Western blotting –menetelmää erilaisten ?-kateniinin fosforylaatiomuotojen määrittämiseksi paksusuolisyöpämallien kudos- ja solunäytteistä. Optimoitua menetelmää käytettiin mittaamaan fosfo-Ser552- ja fosfo-Ser675-?-kateniinipitoisuudet näytteistä, jotka olivat peräisin kahdesta osastolla aiemmin ApcMin-hiirillä tehdystä dieettitutkimuksesta. Tavoitteena oli nähdä, vaikuttavatko tutkimusdieetit fosfo-?-kateniinin määrään hiirien suoliston limakalvossa ja ovatko fosfo-?-kateniinipitoisuudet yhteydessä suolistokasvaimien muodostumiseen. Aineisto- ja menetelmät: Tutkimuksessa hyödynnettiin aikaisemmista tutkimuksista peräisin olevia ihmisen paksusuolisyövän solunäytteitä ja paksusuolisyövän eläinmallin, ApcMin-hiiren suoliston limakalvonäytteitä. Näitä näytteitä käytettiin kehittämään fluoresenssiin pohjautuvaa menetelmää ?-kateniinin eri fosforylaatiomuotojen (Ser33/37/Thr41, Thr41/Ser45, Ser552, Ser675 ja Tyr654) mittaamiseksi saatavilla olevilla kaupallisilla vasta-aineilla. Kehitetyllä menetelmällä analysoitiin kokonais-, fosfo-Ser552- ja fosfo-Ser675-?-kateniinipitoisuudet kahdesta ApcMin-hiirillä tehdystä tutkimuksesta, joissa toisessa oli tutkittu kasvistanolin ja toisessa ns. länsimaisen, paljon rasvaa, vähän kalsiumia ja D3-vitamiinia sisältävän dieetin vaikutusta suolistokasvaimien muodostumiseen. Tulokset analysoitiin PASW Statistics 18.0 – ohjelmalla käyttämällä Mann-Whitney U -testiä ja Spearmanin järjestyskorrelaatiota. Tulokset: Fluoresenssiin pohjautuva menetelmä toimi määritettäessä fosfo-Ser552- ja fosfo-Ser675-?-kateniinia solu- ja hiirinäytteistä sekä fosfo-Ser33/37/Thr41-?-kateniinia solunäytteistä. Olosuhteita ei saatu optimoitua fluoresenssiin pohjautuvalle menetelmälle soveltuvaksi analysoitaessa fosfo-Tyr654- ja fosfo-Thr41/Ser45-?-kateniinia solu- ja hiirinäytteistä sekä fosfo-Ser33/37/Thr41-?-kateniinia hiirinäytteistä. Perinteisellä kemiluminesenssiin perustuvalla menetelmällä saatiin signaali fosfo-Thr41/Ser45-?-kateniinista solunäytteistä, mutta ei hiirinäytteistä. Kasvistanolidieettiä saaneilla hiirillä oli tilastollisesti merkitsevästi enemmän suolistokasvaimia verrattuna kontrollihiiriin (p=0,002). Kasvistanolidieettiryhmällä oli tilastollisesti merkitsevästi enemmän ?-kateniinia (p=0,043) ja fosfo-Ser675-?-kateniinia (p=0,027) kuin kontrolliryhmällä. Fosfo-Ser552-?-kateniini noudatti samaa trendiä kuin fosfo-Ser675-?-kateniini, mutta ryhmien välinen ero ei aivan saavuttanut tilastollista merkitsevyyttä (p=0,077). Länsimaista dieettiä saaneille hiirille muodostui tilastollisesti merkitsevästi enemmän suolistokasvaimia kuin kontrollihiiriille (p=0,002). Länsimaista dieettiä saaneilla hiirillä oli systemaattisesti enemmän ?-kateniinia ja sen fosforyloituneita muotoja (Ser552 ja Ser675) kuin kontrollihiirillä, mutta erot eivät saavuttaneet tilastollista merkitsevyyttä (p=0,165, p=0,198, p=0,440). Johtopäätökset: Uusi, fluoresenssiin perustuva menetelmä soveltuu paremmin ?-kateniinin fosforylaatiomuotojen määrittämiseen kuin perinteinen, kemiluminesenssiin pohjautuva menetelmä, sillä fluoresenssiin perustuvalla menetelmällä voidaan analysoida samanaikaisesti sekä ?-kateniinin fosforylaatiomuotoa että kokonais-?-kateniinia toisin kuin perinteisellä kemiluminesenssiin pohjautuvalla menetelmällä. Tulosten perusteella ravinnolla voidaan vaikuttaa ?-kateniinin fosforylaatioon. Erityisesti kasvistanolit lisäsivät ?-kateniinin fosforyloitumista sekä seriini675-aminhappotähteestä että vähäisemmässä määrin seriini552-aminohappotähteestä. ?-kateniinin fosforyloituminen seriini675-aminohappotähteestä todennäköisesti ehkäisi ?-kateniinin hajottamista, mikä on voinut lisätä sen määrää sytosolissa. ?-kateniinin fosforyloituminen seriini552-aminohappotähteestä saattoi edistää vapaana sytosolissa olevan ?-kateniinin siirtymistä tumaan. Tumassa ?-kateniini on ilmeisesti osallistunut kiihtyneeseen suolistokasvaimien muodostumiseen lisäämällä proto-onkogeenien ilmentymistä.Background Protein called ?-catenin has the key role in the Wnt signaling pathway which induces cell division and growth. The disruption of the ?-catenin degradation can lead to uncontrolled cell division and development of colon cancer due to ?-catenin´s ability to enhance the expression of the proto-oncogenes in Wnt singaling pathway. Cells control ?-catenin by degradation and phosphorylation. Phosphorylated ?-catenin at serine675 and serine552 residues increases proto-oncogene expression, and thereby promotes colon cancer formation. At present, only few research articles have addressed whether diet can affect the phosphorylation status of ?-catenin in the intestinal mucosa. Objective The objective of the master´s thesis was to develop fluorescence-based western blotting method to analyze phosphorylated ?-catenin forms from colon cancer cell and intestinal mucosa tissue samples. Optimized method was used to analyze phospho-Ser675- and phospho-Ser552-?-catenin from samples derived from two dietary studies conducted with ApcMin mice. The aim of this was to determine whether dietary components have effect on phosphorylation of ?-catenin in the intestinal mucosa tissue and whether phosphorylated ?-catenin correlated with intestinal adenoma number and size. Materials and methods Fluorescence-based western blotting method was developed to analyze all the ?-catenin phosphorylation forms that can be detected by using commercially available antibodies (Ser33/37/Thr41, Thr41/Ser45, Ser552, Ser675 and Tyr654). Phospho-?-catenin was measured from samples obtained from colon cancer cells lines and intestinal mucosa tissue of ApcMin mice (a model of colon cancer). Optimized method was used to analyze ?-catenin, phospho-Ser675- and phospho-Ser552-?-catenin levels from normal intestinal mucosa samples of ApcMin mice originated from two dietary studies. In the first study mice were fed 0,8 % plant stanol diet and in the second study mice were fed western type diet which contained high levels of fat and saturated fat and low levels of calcium and vitamin D3. The aim of the two studies was to determine whether plant stanol and western type diet have effect on tumor formation. Statistical analyses were made by using Mann-Whitney U test and Spearman correlation (PASW Statistics 18.0 software). Results By using fluorescence-based western blotting method phospho-Ser675- and phospho-Ser552-?-catenin were detected in cell and mouse samples as well as phospho-Ser33/37/Thr41-?-catenin in cell samples. The method could not be optimized for the detection of phospho-Tyr654- and phospho-Thr41/Ser45-?-catenin in cell and mouse samples and phospho-Ser33/37/Thr41-?-catenin in mouse samples. However, phospho-Thr41/Ser45-?-catenin was detected in cell samples but not in mouse samples by using the chemiluminescence-based western blotting method. The adenoma number was significantly higher in mice fed plant stanol diet than in control mice (p=0,002). Plant stanol diet resulted in significantly higher levels of ?-catenin (p=0,043) and phospho-Ser675-?-catenin (p=0,027) compared with control diet. Although, phospho-Ser552-?-catenin followed the same trend as phospho-Ser675-?-catenin, the levels of phospho-Ser552-?-catenin did not reach statistical significance between plant stanol and control group (p=0,077). Mice consumed western type diet had significantly higher number of adenomas than control mice (p=0,002). The levels of ?-catenin and phosphorylated ?-catenin (Ser552 and Ser675) were consistently higher in western type diet mice than control mice but there were no significant differences between the groups (p=0,165, p=0,198, p=0,440). Conclusions Fluorescence-based western blotting method is more reliable for analyzing ?-catenin phosphorylation forms than chemiluminescence-based western blotting method: unlike chemiluminescence-based western blotting method, fluorescence-based western blotting method can allow the detection ?-catenin and phospho-?-catenin at the same time. Based on results, diet can affect ?-catenin phosphorylation. Especially plant stanol diet increased ?-catenin fosforylation at residues serine675 as well as serine552 but less significantly in the intestinal mucosa. Phosphorylation of serine675 residue inhibits ?-catenin degradation which seems to have increased the cytosolic level of ?-catenin. Phosphorylation of serine552 residue has probably induced ?-catenin to translocate from the cytoplasm to the nucleus. Inside the nucleus ?-catenin may have promoted tumor formation by increasing the expression of proto-oncogenes.
Subject: Ser675
Ser552
β-catenin
phosphorylation
colon cancer
β-kateniini
fosforylaatio
suolistosyöpä


Files in this item

Total number of downloads: Loading...

Files Size Format View
Gradu_Heli Diaz 2.3.2014.pdf 2.103Mb PDF View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record