PCR-menetelmä ryhmän I (proteolyyttisten) ja ryhmän II (ei-proteolyyttisten) Clostridium botulinum -kantojen erottamiseksi toisistaan

Show full item record

Permalink

http://hdl.handle.net/1975/1038
Title: PCR-menetelmä ryhmän I (proteolyyttisten) ja ryhmän II (ei-proteolyyttisten) Clostridium botulinum -kantojen erottamiseksi toisistaan
Author: Dahlsten, Elias
Abstract: Clostridium botulinum on ehdottoman anaerobinen gram-positiivinen sauvabakteeri ja vaarallinen ruokamyrkytyspatogeeni. Sen tuottama hermomyrkky, botulinumtoksiini, aiheuttaa hengenvaarallista botulismia ihmisillä ja eläimillä. C. botulinum muodostaa itiöitä, jotka säilyvät äärimmäisissäkin ympäristöolosuhteissa. C. botulinum -kannat jaetaan metabolisten ominaisuuksiensa perus-teella ryhmiin I-IV, joista ryhmät I ja II ovat ihmisille vaarallisia neurotoksiineja tuottavia. Ryhmän I kannat ovat proteolyyttisiä ja ryhmän II kannat ei-proteolyyttisiä. Bakteerin tuottaman toksiinin tyypin perusteella kannat jaetaan toksinotyyppeihin A-G, joista ryhmään I kuuluvat tyypit A, B ja F sekä ryhmään II tyypit B, E ja F. Koska samaa toksinotyyppiä olevia kantoja esiintyy sekä ryhmässä I että ryhmässä II, pelkän toksinotyypin perusteella kantojen erottelu ryhmiin ei ole mahdollista. Samaa toksinotyyppiä olevissa eri metabolisiin ryhmiin kuuluvissa kannoissa ainoa yhteinen tekijä on tuotetun toksiinin tyyppi. C. botulinum -kantojen tyypittämiseksi ryhmiin on tällä hetkellä käytössä erilaisia molekyyli-biologisia menetelmiä, sekä perinteinen mikrobiologinen menetelmä jolla saadaan selville kannan proteolyyttisyys tutkimalla sen kykyä hajottaa kaseiinia. Molekyylibiologisista menetelmistä mainittakoon AFLP ja ribotyypitys. Menetelmien ongelmina ovat mm. niiden hitaus ja työläys sekä perinteisessä mikrobiologiassa epätarkka tulkinta. Tässä tutkimuksessa etsittiin ryhmien I ja II C. botulinum -kantoja erottelevat geenialueet DNAmikrosirutekniikan avulla. Ryhmien I ja II kaikista eri toksino-tyyppisistä (ryhmä I: A, B, F; ryhmä II: B, E, F) C. botulinum -kannoista eristetyt puhtaat DNA-näytteet leimattiin fluoresoivalla merkkiaineella ja hybridisoitiin C. botulinum ATCC 3502 DNA-mikrosirulle kilpailevaa hybridisaatiota käyttäen. Kontrollina käytettiin C. botulinum ATCC 3502 -kannan DNA:ta. DNA-mikrosirulla oli koettimina PCR-tuotteet ATCC 3502 -kannan kaikista geeneistä. Siten kaikkien näiden geenien läsnäoloa näytteessä pystyttiin tutkimaan yhdellä DNA-mikrosirukokeella. DNA:n hybridisaatioastetta koetinkohtaisesti tutkimalla etsittiin suurimman logaritmisen intensiteettieron ryhmien I ja II välillä antaneet geenialueet. Tunnistettujen alueiden perusteella suunniteltiin kuusi ryhmän I kannoille spesifistä alukeparia, joista kahden (CBO0250F/R ja CBO1073F/R) toimivuus testattiin 60 ryhmän I ja II eri toksinotyyppisellä C. botulinum -kannalla. PCR-menetelmä ryhmien I ja II erottamiseksi toisistaan optimoitiin käyttäen alukeparia CBO0250F/R, joka erotteli tarkasti kaikki 60 testattua C. botulinum -kantaa ryhmiin I ja II. Kehitetyllä PCR- menetelmällä voidaan erotella C. botulinum -kannat ryhmiin I ja II aikaisempiin molekyylibiologiin menetelmiin verrattuna huomattavasti nopeammin ja perinteisiin menetelmiin verrattuna luotettavammin. Menetelmä soveltuu rutiinikäyttöön C. botulinum -kantojen ryhmiin I ja II tyypittämiseen. Yksinkertaisten ja nopeiden tyypitysmenetelmien käyttö osana C. botulinumin diagnostiikkaa olisi tärkeää tautitapausten epidemiologisessa selvitystyössä, ja niitä tulisikin ottaa mahdollisimman paljon rutiinikäyttöön.
Description: Elintarvikehygienia. Vain tiivistelmä. Koko työ lainattavissa Viikin tiedekirjastosta.
URI: http://hdl.handle.net/1975/1038
Date: 2006
Subject: Clostridium botulinum
ryhmät I ja II
proteolyyttinen
ei-proteolyyttinen
metabolinen ryhmä
diagnostiikka
genotyyppiset erot
DNA-mikrosirutekniikka
PCR


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record