Lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien 16S rRNA geenin V3 alueen monistumiserojen mittaaminen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä

Show full item record



Permalink

http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201804208046
Title: Lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien 16S rRNA geenin V3 alueen monistumiserojen mittaaminen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä
Author: Mikola, Karoliina
Contributor: University of Helsinki, Faculty of Veterinary Medicine, Department of Food and Environmental Hygiene
Publisher: Helsingfors universitet
Date: 2005
URI: http://urn.fi/URN:NBN:fi-fe201804208046
http://hdl.handle.net/1975/1405
Abstract: PCR-pohjaisissa viljelystä riippumattomissa menetelmissä geenin monistumistehokkuuden eroavuudet voivat aiheuttaa epätarkkuutta mikrobiyhteisöstä saatuun kuvaan. Tässä tutkimuksessa arvioitiin 16S rRNA -geeniin sitoutuvan universaalin alukeparin soveltumista lihan pilaantumisen kannalta merkittävien maitohappobakteerien tutkimiseen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Työssä tutkittiin yhteensä 36 maitohappobakteerien tyyppi- ja referenssikantaa Carnobacterium-, Enterococcus-, Lactobacillus-, Lactococcus-, Leuconostoc- ja Weissella-suvuista. Maitohappobakteerien lisäksi tutkittiin Brochothrix thermospacta -lajin tyyppi- ja referenssikantaa. Bakteerikannat kasvatettiin MRS- tai TS-elatusaineilla anaerobisissa olosuhteissa. DNA:n eristykseen käytettiin muokattua Pitcherin menetelmää. Templaatti-DNA:n laatu ja konsentraatio määritettiin spektrofotometrisesti. PCR-monistus tehtiin reaaliaikaisella kapillaarilaitteella (LightCycler®) SYBR Green –kemiaa käyttäen, jolloin PCR-tuotteen muodostumista voitiin seurata ajon aikana. Monistuksessa käytettiin HDA1/HDA2 –alukeparia, jossa HDA1-alukkeeseen oli kiinnitetty GC-häntä. Kunkin ajon jälkeen LightCycler™ ohjelmisto ilmoitti kullekin reaktiolle kynnysarvon (Cp, crossing point). Lisäksi ajo-ohjelma suoritti sulamiskäyräanalyysin kullekin tuotteelle. Lopuksi PCR-tuotteet ajettiin vielä etidiumbromidilla värjätyssä agaroosigeelissä. Templaatit monistuivat käytetyillä alukkeilla hyvin ja agaroosigeelielektroforeesin perusteella kustakin kannasta saatiin odotetun kokoinen PCR-tuote. Kynnysarvot vaihtelivat eri lajeilla 9,9:stä 18,5:een. Myös saman lajin eri kantojen kynnysarvot poikkesivat toisistaan, mutta erot eivät olleet aivan yhtä suuria kuin tarkasteltaessa kaikilta lajeilta saatuja arvoja. Brochothrix thermospacta -kannat ja Weissella-suvun kannat monistuivat tehokkaimmin, Carnobacterium- ja Enterococcus-sukujen kannat heikoimmin. Kuten oli odotettavissa, GC-hännällisistä tuotteista muodostui kaksi sulamispistettä. Alempi sulamispiste havaittiin lämpötila-alueella 80,5-84,2 °C ja ylempi lämpötila-alueella 83,7-90,7 °C. Lactobacillus-suvussa alempien sulamispisteiden lajien väliset vaihtelut olivat suurimmat, Weissella- ja Enterococcus-suvuissa pienimmät. Tutkitulla alukeparilla maitohappobakteerien monistumisen kynnysarvot poikkesivat viitaten amplifikaatiotehokkuuksien eroihin. Tästä johtuen populaatiota kuvaavaan sormenjälkeen saattaa muodostua epätarkkuuksia, mitä tullaan jatkossa tutkimaan DGGE-menetelmällä.
Subject: PCR-DGGE
viljelystä riippumattomat menetelmät
16S rRNA geeni
reaaliaikainen PCR
Discipline: Food Hygiene
Elintarvikehygienia
Livsmedelhygien


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show full item record